Как читать хроматограмму и масс-спектр пептида

Обновлено 19 октября 2026 года

Аналитический отчёт пептида документирует результаты исследования образца. Хроматографические и масс-спектрометрические данные позволяют оценить его относительную однородность и сопоставить зарегистрированные сигналы с ожидаемой молекулярной массой.

Хроматограмма отражает разделение компонентов и отклик детектора во времени. Таблица пиков содержит результаты обработки: времена удерживания, площади и относительные площади. Масс-спектр показывает распределение ионных сигналов по отношению массы к заряду.

Корректная интерпретация предполагает различение измеренных величин и выводов, полученных на их основе. В частности, относительная площадь хроматографического пика не равнозначна массовой доле пептида, а значение m/z требует учёта заряда и состава иона.

Каждый раздел связывает принцип метода с соответствующим элементом отчёта. Оси, подписи пиков и столбцы таблицы отмечены нумерованными указателями; пояснения раскрывают их аналитическое значение.

Практический разбор выполнен на примере аналитического отчёта пептида Survodutide (сурводутид). Приведённые хроматограмма, масс-спектр и экспериментальные значения относятся к этому образцу.

Аналитический отчёт пептида: ВЭЖХ и масс-спектрометрия

Аналитический отчёт описывает результаты проверки образца. Обычно в нём есть название вещества, сведения об исследуемом образце, результаты испытаний и инструментальные материалы — хроматограммы и масс-спектры.

Задачи ВЭЖХ и масс-спектрометрии

Хроматография разделяет компоненты смеси и позволяет оценить относительную однородность образца в условиях выбранной методики.

Масс-спектрометрия регистрирует отношения массы ионов к заряду и позволяет сопоставить наблюдаемые сигналы с ожидаемой массой пептида.

Эти методы дополняют друг друга. Крупный пик на хроматограмме сам по себе ещё не устанавливает химическую структуру. Подходящая масса в масс-спектре, в свою очередь, не означает, что в образце нет примесей.

Последовательность рассмотрения данных

Вначале проверяют идентификационные сведения об образце, затем рассматривают хроматограмму и таблицу пиков. После этого оценивают масс-спектр. Такой порядок позволяет последовательно сопоставить результаты двух методов.

В нашем примере сначала рассматривается УФ-хроматограмма с таблицей относительных площадей. Затем — график ионного тока и масс-спектр. Именно эти изображения будут сопровождать объяснения.

Установленные требования и результаты измерений

В отчёте различают установленное требование и фактический результат. Требование задаёт критерий оценки; результат характеризует исследованный образец. При интерпретации графиков используют данные измерений.

Предмет руководства — интерпретация графиков, таблицы пиков и инструментальных подписей. Подробная оценка спецификации в него не входит.

Как работает ВЭЖХ при анализе пептидов

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография. Метод основан на различиях во взаимодействии компонентов образца с неподвижной и подвижной фазами, благодаря которым компоненты выходят из колонки в разное время.

Раствор образца вводят в поток подвижной фазы, проходящий через колонку с сорбентом. Компоненты, сильнее взаимодействующие с неподвижной фазой в данных условиях, удерживаются дольше.

После колонки детектор регистрирует выход компонентов. Программное обеспечение формирует хроматограмму — зависимость сигнала детектора от времени.

При анализе пептидов часто применяют обращённо-фазовые колонки C18 с гидрофобной поверхностью. Различия в удерживании позволяют регистрировать компоненты раздельно.

Время выхода зависит не только от самого вещества, но и от условий анализа. Поэтому один и тот же пептид на другой колонке или при другом составе жидкости может дать пик в другое время. Сравнивать такие значения правильно только в сопоставимых условиях.

Как читать хроматограмму: время удерживания и пики

На горизонтальной оси показано время. На вертикальной — сила сигнала детектора. Когда из колонки выходит компонент, сигнал возрастает и образует пик.

Время удерживания, или RT, — время от ввода образца до точки пика, обычно его вершины. На изображении основной пик подписан 10,400 мин, небольшой дополнительный — 9,093 мин. Соответствующие подписи выделены указателями 3 и 4.

В этом отчёте используется УФ-детектор: он регистрирует поглощение света на выбранной длине волны. Его отклик помогает обнаружить выходящие компоненты. Высота пика показывает силу сигнала, но сама по себе ещё не является процентом чистоты.

Один хроматографический пик может включать несколько совместно выходящих компонентов. Поэтому одиночный пик сам по себе не доказывает химическую однородность и не устанавливает структуру вещества.

Чистота пептида по ВЭЖХ: площадь пика и расчёт

Хроматографическую чистоту по нормализации площадей определяют из таблицы пиков. Различают площадь пика и его относительную площадь. Соответствующие столбцы выделены на исходном фрагменте.

Столбец Area содержит площадь под каждым пиком. Программа суммирует сигнал за время выхода компонента. Столбец Area % показывает, какую долю этот пик занимает в сумме учтённых площадей.

Относительная площадь основного пика — 99,7711%.
Относительная площадь примеси — 0,2289%.
Эти значения получены нормализацией площадей и показаны на увеличении.

Доля основного пика = его площадь / сумма площадей × 100%

В данном случае: 4752,93506 / (4752,93506 + 10,90212) × 100% = 99,7711% после округления. Эти числа взяты из столбца Area, отмеченного указателем 2.

Для такого расчёта используют площадь, а не высоту: широкий и узкий пики одинаковой высоты могут содержать разный суммарный сигнал.

Хроматографическая чистота и массовая доля пептида

Относительная площадь 99,7711% означает, что основной пик составляет указанную долю суммы площадей, включённых в расчёт данной УФ-хроматограммы.

Хроматографическая чистота и массовая доля

Этот процент нельзя автоматически читать как массовую долю пептида в порошке. В образце могут присутствовать вода, противоионы и другие компоненты, которые не учитываются таким расчётом или дают иной отклик.

Поэтому «99,7711% по ВЭЖХ» не означает, что в любых 100 мг содержится ровно 99,7711 мг пептида. Для определения фактического содержания применяют отдельные количественные методы.

Интерпретация дополнительного пика

Пик при 9,093 мин с площадью 0,2289% показывает небольшой дополнительный сигнал. По одному времени удерживания нельзя назвать его конкретной примесью или установить, откуда он появился.

Дополнительный сигнал может соответствовать родственному соединению, продукту изменения вещества или другому регистрируемому компоненту. Определение его химической природы требует дополнительных данных; хроматограмма устанавливает его время удерживания и относительную площадь.

Влияние интегрирования

Программа должна выбрать, где начинается и заканчивается каждый пик и где проходит базовая линия. Эту обработку называют интегрированием. От её правил зависит, какие сигналы попадут в расчёт, особенно если они малы.

Четыре знака после запятой — формат результата программы. Они не означают, что весь метод имеет точность до одной десятитысячной процента.

Показатель чистоты по ВЭЖХ интерпретируют совместно с хроматограммой, таблицей пиков и условиями анализа.

Ионизация пептидов и зарядовые состояния в MS

Масс-спектрометрия регистрирует заряженные частицы — ионы. При анализе пептидов часто применяют электроспрей-ионизацию: раствор распыляется в электрическом поле, растворитель испаряется, и образуются газофазные ионы.

В положительном режиме пептид может присоединить один или несколько протонов. Если присоединены три протона, ион несёт заряд +3; если четыре — заряд +4. Обозначения [M+3H]³⁺ и [M+4H]⁴⁺ описывают именно такие состояния.

Прибор показывает не непосредственно массу нейтральной молекулы, а m/z — отношение массы иона к его заряду. Чем больше заряд той же молекулы, тем меньше значение m/z.

Многозарядность позволяет регистрировать пептид массой более 4000 Да при значениях m/z около 1000–1500. Уменьшение m/z при увеличении заряда не означает уменьшения массы нейтральной молекулы.

Поэтому несколько линий в масс-спектре не обязательно означают несколько разных пептидов. Прежде чем говорить о примесях, нужно проверить, могут ли линии быть разными зарядовыми состояниями одного вещества.

Как читать масс-спектр пептида: оси и сигналы

В масс-спектре горизонтальная ось показывает m/z, а вертикальная — интенсивность ионов. Это другой график: время здесь указано отдельно в метке выбранного скана.

Указателями выделены значения 1059,4; 1411,9 и 1694,3. Это координаты сигналов по оси m/z. Самая высокая из подписанных линий — 1411,9: она показывает наиболее сильный ионный отклик в этом спектре.

Отношения высот MS-сигналов не определяют хроматографическую чистоту: эффективность ионизации и регистрации зависит от вещества и условий анализа. Значение 99,7711% рассчитано по площадям УФ-пиков.

Расчёт молекулярной массы пептида по m/z

Для иона, заряд которого образован присоединением протонов, связь между m/z, зарядом и нейтральной массой описывается формулами:

m/z = M/z + 1,007276
M = z × (m/z − 1,007276)

Здесь M — масса нейтральной молекулы, z — число зарядов, а 1,007276 Да — масса протона. В рассматриваемом отчёте для пептида Survodutide указана молекулярная масса 4231,62 Да. Для зарядов +3 и +4 получаются следующие расчётные значения.

Такая картина допускает предварительное объяснение: 1411,9 может быть ионом +3, а 1059,4 — ионом +4. При этом точное совпадение с указанной массой отсутствует. Обратный расчёт даёт примерно 4232,68 и 4233,57 Да, а не ровно 4231,62 Да.

Поэтому корректно говорить о предварительном соответствии массе около 4,23 кДа. Чтобы подтвердить точную массу и заряды, нужны исходные данные прибора и сведения об обработке. По одной распечатке нельзя надёжно выяснить причину расхождения.

Как уточняют заряд

На более подробном спектре один сигнал может выглядеть как группа близких изотопных линий. По расстоянию между ними можно определить заряд. На нашем общем изображении такие линии не различимы, поэтому этот способ нельзя применить непосредственно к скриншоту.

Интерпретация сигнала m/z 1694,3

Этот сигнал не подходит как обычный протонированный ион одиночной молекулы массой 4231,62 Да с целым зарядом. Его природа не установлена. Назначение сигнала и его отнесение к конкретной примеси требуют дополнительных данных.

TIC и задержка между УФ- и MS-детекторами

TIC — хроматограмма общего ионного тока. Она отражает изменение суммарной интенсивности зарегистрированных ионов во времени.

Здесь показаны положительный и отрицательный режимы. Их кривые могут отличаться от УФ-графика, потому что детекторы измеряют разные свойства. Рассчитывать по ним тот же УФ-процент чистоты нельзя.

Временной сдвиг между детекторами

В хроматомасс-спектрометре поток может проходить последовательно через УФ-детектор и затем через источник MS. Прохождение соединительных капилляров требует определённого времени. Поэтому между регистрацией одного компонента разными детекторами возникает естественная задержка.

В нашем примере основной УФ-пик подписан 10,400 мин, а выбранный MS-скан — 9,8 мин. Для сопоставления учитывают задержку, порядок детекторов и начало отсчёта времени. Если MS расположен после УФ и шкала времени общая, MS-сигнал ожидают позже. Поэтому именно направление сдвига в этих распечатках требует проверки по настройкам и исходной записи.

Порядок интерпретации аналитического отчёта

Интерпретацию результатов выполняют последовательно, сопоставляя сведения об образце, хроматографические данные и масс-спектр.

1. Проверьте образец

Убедитесь, что название, идентификатор образца и дата относятся к нужному анализу.

2. Найдите основной пик на хроматограмме

Прочитайте подпись времени удерживания. Посмотрите, есть ли дополнительные пики. В нашем примере это 10,400 и 9,093 мин.

3. Сверьте таблицу площадей

Ищите столбец Area %. Здесь он показывает 99,7711% для основного пика и 0,2289% для малого. Помните, что это относительные площади, а не автоматически массовый состав порошка.

4. Перейдите к масс-спектру

Найдите ось m/z, метку скана и подписанные сигналы. Не считайте каждый сигнал отдельным веществом: возможны разные заряды одной молекулы.

5. Отделите наблюдение от вывода

График показывает измеренные сигналы. Заряд и природу иона устанавливают при их интерпретации. Если данных недостаточно, назначение оставляют предварительным.

Заключение

Хроматограмма помогает оценить относительную однородность образца. Масс-спектр помогает проверить связь сигналов с ожидаемой массой. Ни один из этих графиков сам по себе не доказывает всю структуру пептида: для этого могут потребоваться дополнительные исследования, в том числе анализ фрагментов молекулы — MS/MS.

Обоснованный аналитический вывод связывает каждый показатель с методом его получения и учитывает ограничения представленных данных.

Связанные материалы

• Трифтороацетат или ацетат: солевая форма и аналитический контроль пептида
• Что такое пептиды: свойства и области применения