Новые пептиды эзрина. Гепон и его более активные аналоги

Гепон (Hepon) является зарегистрированным в РФ лекарственным средством (ЛСР-001794/07), которое назначают при иммунодефицитных состояниях, для терапии ВИЧ, стимулирования иммунной защиты организма и др. Препарат малотоксичен и не оказывает побочных эффектов. Данному синтетическому тетрадекапептидну соответствует следующая аминокислотная последовательность [1]:

Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu (TEKKRRETVEREKE)

Гепон был создан для лечения и профилактики синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) и сопутствующих заболеваний в 1994 году [1]. Механизм действия препарата основан на способности индуцировать α- и β-интерфероны, подавлять воспалительный ответ и стимулировать гуморальный иммунитет, благодаря чему активируется иммунная защита организма и проявляются противовирусные свойства [2-6]. Подробнее с биологической активностью, свойствами и результатами клинических испытаний Гепона можно ознакомиться в нашем предыдущем обзоре.

Положительные качества Гепона подтолкнули исследователей к разработке на его основе новых, более эффективных, аналогов. В лабораториях компании Nearmedic International Ltd была синтезирована и изучена серия родственных пептидов длиной 5–14 аминокислотных остатков на основе белка эзрин [7]. Полученные соединения были запатентованы в странах ЕС, Тихоокеанского региона, а также на территории России [8]. Эзрин (син. виллин-2, цитовиллин) является полипептидом цитоскелета, состоит из 586 аминокислотных остатков и обладает массой 69,4 кДа, который входит, наряду с моезином и радиксином, в высококонсервативное семейство белков ERM. Эти белки ERM белки сшивают актиновые филаменты с плазматическими мембранами, связываясь с CD44, гликопротеином клеточной поверхности, участвующим в межклеточных взаимодействиях, клеточной адгезии, миграции и организации структуры клеточной поверхности, через их N-концевые домены и с филаментами актина через их С-концевые домены [9]. Структура эзрина стала основой для многих биологически активных соединений, включая Гепон, которым соответствует общая формула X1ЕKKRRЕTVЕRЕX2X3, в которой X1–3 является неполярными фрагментами (Ala, Val, Gly, ILe, Leu, Met, Pro, Trp, Phe или сочетание перечисленных аминокислот), а минимум два из них представляют собой Gly; оптимальные пептидные последовательности приведенные ниже (Таблица 1). Кроме того, патентом предусмотрено использование  комбинаций разработанных пептидов (Таблица 2).

 

Таблица 1 – Аналоги Гепона

 

Последовательность*НазваниеПримечаниеСсылки
1GEKKRRETVEREGGHP-V2 [7]
2TEKKRRETVEREKEHEP-1ЛС Гепон[10, 11]
3TEKKR         НР1-5Примесь из Гепона[7]
4     RETVEREKEНР6-14Примесь из Гепона[7]
5X1EKKRRETVEREX2X3 Общая формула[7]
6Комбинации №№14 См. Таб. 2[7]

 

* Начертанием выделены совпадающие фрагменты пептидов.

 

Таблица 2 – Комбинации аналогов Гепона [7]

Компоненты комбинацииСостав
6a3+290% пептида 2 и 10% пептида 3
6b4+290% пептида 2 и 10% пептида 4
6c1+390% пептида 1 и 10% пептида 3
6d1+490% пептида 1 и 10% пептида 4
6e1+295% пептида 1 и 5% пептида 2

 

Разработанные авторами патента [7] соединения были подвергнуты испытаниям in vitro на противовирусную и иммуностимулирующую активность. Для этого использовались стерильные растворы пептидов 1–5 или их комбинаций 6ae с концентрациями 1–2 мг/мл. Как модельный патогенный агент, исследователями был выбран штамм “Columbia SK-Col-SK” вируса энцефаломиокардита (син. вирус параполиомиелита или вирус полиоэнцефалита грызунов), относящийся к роду энтеровирусов, семейства пикорнавирусов, который вызывает у человека лихорадочное заболевание с поражением центральной нервной системы.

Для испытаний были выбраны три чувствительные к вирусам перевиваемые (т.е., способные размножаться in vitro неопределенно долго, «бессмертные») клеточные линии: гепатоцеллюлярного рака (гепатома, ГЦР) человека PI-C/PRF/5 (Alexander), рака шейки матки (цервикальной карциномы, РШМ) человека HeLa и линия эпителиальных клеток сердца человека Girardi. Клетки выращивали в 96-луночных планшетах в соответствующей питательной среде с плотностью ~ 200 тыс. клеток на 1 мл. Через три дня от начала культивации, все культуры инфицировали вирусом энцефаломиокардита в дозировке 100 ЦПД50/мл (где ЦПД50 – доза вируса, вызывающая цитопатический эффект, т.е, специфическую деструкцию структуры и функциональную патологию пораженных клеток, культивируемых вне организма, у 50% зараженных клеток). Также культивировали и обрабатывали контрольные клетки, зараженные вирусом, но без введения растворов пептидов. Затем, на четвертый день, микроскопическим методом оценивали цитопатический эффект вируса.

Противовирусное действие разработанных пептидов устанавливали исходя из их низшей концентрации, предохраняющей 50% клеток от гибели под действием вируса энцефаломиокардита, вводимого в дозировке 100 ЦПД50/мл. Титр интерферона обсчитывали как значение, обратное высшему разведению исследуемого пептидного препарата, при котором 50% клеток избегали гибели при аналогичном воздействии. Результаты тестов приведены в таблице 3.

 

Таблица 3 – Противовирусное действие пептидов

Максимальная концентрация, (мкг/мл)Противовирусная активность, (мкг/мл)Титр индуцированного интерферона, (ед/мл)
Модель – клеточная линия ГЦР PI-C/PRF/5
21003,0320

 

31001,6640
41000,781280
6a (3+2)20062,516
6b (4+2)20062,516
6c (1+3)1000,110240
6d (1+4)1003,0320
6e (1+2)1000,781280
11000,781280
Модель – клеточная линия РШМ HeLa
210003,9256
310000,492048
410000,492048
6a  (3+2)20007,8256
6b (4+2)20001,951024
6c (1+3)10000,971024
6d (1+4)10000,492048
6e (1+2)10007,8128
Модель – клеточная линия клеток сердца
210000,0015655360
310000,0015655360
410000,006163840
6a (3+2)20000,00054194304
6b (4+2)20000,00054194304
6c (1+3)10000,00025242880
6d (1+4)10000,006163840
6e (1+2)10000,00081310720
110000.0015655360

 

Из результатов испытаний, видно, что все описанные в патенте [7]  пептиды и их комбинации подавляют репликацию вируса энцефаломиокардита в клетках гепатоцеллюлярного рака человека путем индукции выработки интерферона. Наивысший уровень противовирусной активности на клетках ГЦР наблюдался в случае применения пептида пептидом 1 и его композицией с пептидом 3.

Для модели на клетках рака шейки матки изученные также показано, что пептиды способствуют подавлению развития вирусной инфекции, усиливая синтез интерферона. Лучшее противовирусное показано для пептида 3 и пептида 4, как и для их смесей с пептидами 1 и 2.

Пептиды эффективно стимулировали образование интерферонов и защищали линии эпителиальные клетки сердца. Выраженный противовирусный  эффект был показан при применении  смесей пептида 2 с пептидом 3 и пептидом 4, а также – пептида 1 с пептидом 3 и с пептидом 2.

Таким образом, разработанный авторами патента [7] препарат 1 демонстрирует выраженное иммуностимулирующее действие, близкое или четырехкратно превышает эффект  ранее описанного пептида 2 – Гепона. Также, смеси новых пептидов на основе молекулы 1 в несколько раз превышают по эффективности Гепон и композиции с ним.

Другая серия экспериментов, описанная в патенте [7], была направлена на исследование воздействия полученных пептидов на молекулярный механизм пролиферации клеток и восстановления тканей. Ранее было показано, что на пролиферацию клеток кишечника влияет экспрессия трансформирующего фактора роста бета (TGFP) [12], тогда как гликопротеин фактор роста фибробластов (bFGF) играет важную роль в  заживлении язвенных поражений и ран [13], как и NGF – фактор роста нервов [14], который способен стимулировать  миграцию фибробластов. Также известно, что для пролиферации клеток существенное влияние оказывает путь МАРК ERK [15]. Разработанные пептиды были испытаны в качестве потенциальных препаратов для терапии воспалительных процессов и изъязвления кишечника. Эксперименты были проведены in vitro на культуре мышиных фибробластов, в которых затем определяли киназы ERK1,  ERK2 и их фосфо-производные. В результате было обнаружено, что пептид 1 в концентрации 10 мкг/мл способен активировать фибробласты, стимулируя сигнальный путь MAPK-ERK через 60 мин после введения в культуральную среду. Концентрации фосфо-киназ ERK1 и ERK2 возросли  в ~3–5 раз по сравнению с контролем. Это указывает на эффективность пептида 1 как потенциального препарата для терапии воспалительных процессов и изъязвления кишечника.

Таким образом, разработанные авторами патента  [7] аналоги Гепона обладают не только выраженным противовирусным и иммуностимулирующим действием, но и способствуют ранозаживлению, причем новые пептиды по всем параметрам превосходят препарат Гепон. В перспективе, необходимо исследовать эти и другие пептиды, последовательности которых входят в белок эзрин, на животных и человеке в клинических условиях, поскольку терапевтический потенциал данных соединений раскрыт еще не полностью.

 

  1. GB 2290293 A, 1994.
  2. Silin, D.S., Lyubomska, O.V., Ershov, F.I., Frolov, V.M., Kutsyna, G., Synthetic and natural immunomodulators acting as interferon inducers. Current pharmaceutical design, 2009. 15(11): p. 1238-1247. DOI: 10.2174/138161209787846847.
  3. Gribencha, S.V., Kholms, R.D., Ataullakhanov, R.I., Barinskiĭ, I.F., [The antiviral activity of the peptide immunomodulator “Gepon” in experimental models of street rabies virus]. Vopr Virusol, 2003. 48(4): p. 40-44.
  4. Баткаев, Э.А., Рюмин, Д.В., Шаков, И.М., Иммуномодулятор «Гепон» в лечении герпетической и кандидозно-трихомонадной инфекций урогенитального тракта. Русский медицинский журнал, 2003. 11(17): p. 962-963.
  5. Горбарец, И.П., Воронкова, Н.В., Лопатина, Т.В., Ивановская, В.Н., Брагинский, Д.М., Опыт применения препарата “Гепон” в сочетании с рекомбинантным интерфероном-альфа у больных хроническим гепатитом С. Русский медицинский журнал, 2003. 12: p. 714.
  6. Abramova, S.N., Lazareva, G.A., Pharmacotherapy exacerbations of chronic inflammatory conditions of female genital sphere using to Gepon and Longidaza. Research Results in Pharmacology, 2016. 2(4): p. 55-67.
  7. US 9682140 B2, 2017.
  8. RU 2694906 C2, 2019.
  9. Yonemura, S., Hirao, M., Doi, Y., Takahashi, N., Kondo, T., Tsukita, S., Tsukita, S., Ezrin/Radixin/Moesin (ERM) Proteins Bind to a Positively Charged Amino Acid Cluster in the Juxta-Membrane Cytoplasmic Domain of CD44, CD43, and ICAM-2. Journal of Cell Biology, 1998. 140(4): p. 885-895. DOI: 10.1083/jcb.140.4.885 %J Journal of Cell Biology.
  10. GB 0301879 D0, 2003.
  11. US 5773573 A, 1998.
  12. Monteleone, G., Neurath, M.F., Ardizzone, S., Di Sabatino, A., Fantini, M.C., Castiglione, F., Scribano, M.L., Armuzzi, A., Caprioli, F., Sturniolo, G.C., Rogai, F., Vecchi, M., Atreya, R., Bossa, F., Onali, S., Fichera, M., Corazza, G.R., Biancone, L., Savarino, V., Pica, R., Orlando, A., Pallone, F., Mongersen, an Oral SMAD7 Antisense Oligonucleotide, and Crohn’s Disease. New England Journal of Medicine, 2015. 372(12): p. 1104-1113. DOI: 10.1056/NEJMoa1407250.
  13. Akita, S., Akino, K., Hirano, A., Basic Fibroblast Growth Factor in Scarless Wound Healing. Advances in Wound Care, 2012. 2(2): p. 44-49. DOI: 10.1089/wound.2011.0324.
  14. Chen, J.-C., Lin, B.-B., Hu, H.-W., Lin, C., Jin, W.-Y., Zhang, F.-B., Zhu, Y.-A., Lu, C.-J., Wei, X.-J., Chen, R.-J., NGF Accelerates Cutaneous Wound Healing by Promoting the Migration of Dermal Fibroblasts via the PI3K/Akt-Rac1-JNK and ERK Pathways. Biomed Res Int, 2014. 2014: p. 547187. DOI: 10.1155/2014/547187.
  15. Raffetto, J.D., Vasquez, R., Goodwin, D.G., Menzoian, J.O., Mitogen-Activated Protein Kinase Pathway Regulates Cell Proliferation in Venous Ulcer Fibroblasts. Vascular and Endovascular Surgery, 2006. 40(1): p. 59-66. DOI: 10.1177/153857440604000108.