Ингибитор интегрина GRGDSP

“Змеиный пептид” Syn-Ake
17.02.2020
Тимозин-β4 или TB-500. Большой обзор
26.02.2020

Противоопухолевое и противометастатическое действие. Создание искусственных трансплантатов.

фибронектин, интегрин, адгезия, молекулы клеточной адгезии, ингибиторы интегрина, сосудистые трансплантаты, сердечно-сосудистые импланты, амфифильность, витронектин, сальмосин, стволовые клетки, онкология/рак, модели: аденокарцинома, меланома, фибросаркома, рак легкого Льюиса, саркома ретикулума, рак мочевого пузыря, рак простаты.

GRGDSP (CAS 91037-75-1) – синтетический пептид, с аминокислотной последовательностью Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro, в основе которой лежит активный фрагмент RGD (Arg-Gly-Asp). GRGDSP используется в качестве растворимого интегрин-блокирующего пептида. Последовательность пептида представляет собой короткий фрагмент фибронектина (внеклеточный гликопротеин, способствующий адгезии, т.е., сцеплению поверхностей, между клеткой и матриксом), а именно – домен адгезии белка внеклеточного матрикса FN III-10 [1]. Фибронектины связывают клеточные поверхности и различные соединения, включая коллаген, фибрин, гепарин, ДНК и актин. Фибронектины участвуют в клеточной адгезии, подвижности клеток, опсонизации (процесс, который способствует фагоцитозу патогенных микроорганизмов), заживлении ран и поддержании формы клеток. Участвуют в уплотнении остеобластов посредством процесса сборки клеточного матрикса, опосредованного фибриллогенезом фибронектина, необходимого для минерализации остеобластов, и регулирует отложение коллагена I типа остеобластами [1].

GRGDSP, на ряду с другими RGD-пептидами, широко применяется в исследованиях интегрина. Интегрины представляют собой довольно большую группу мембранных белков, гликопротеинов, выполняющих функцию трансмембранных клеточных рецепторов, которые регулируют прикрепление клеток, передают различные межклеточные сигналы и ответственны за внеклеточный матрикс. От этих процессов зависит подвижность и форма клеток, регулировка клеточного цикла и формирование новых кровеносных сосудов. С точки зрения иммуннологии, наиболее значимыми лигандами интегринов являются молекулы клеточной адгезии (ICAM), расположенные на воспалённых участках эндотелия и антигенпредставляющих клетках (APC; клетки, экспонирующие на своей поверхности чужеродный антиген с молекулами главного комплекса гистосовместимости для распознавания его Т-лимфоцитами). Молекулами клеточной адгезии называют мембранные белки, участвующие в связывании клетки с внеклеточным матриксом и/или прочими клетками. Ингибиторы интегрина представляют интерес в трех основных областях. Во-первых, ингибиторы интегрина могут привести к разработке лекарств, поскольку изменения активности и экспрессии интегрина характеризуют многочисленные патологические состояния, последствия которых могут быть обращены соответствующими ингибиторами. Специфические ингибиторы отдельных интегринов или определенных групп интегрина помогли прояснить функцию интегринов при патологиях. Во-вторых, с точки зрения определения основной биологической роли интегринов, специфические ингибиторы могут быть использованы для исследования роли отдельных интегринов на клеточном уровне. Наконец, с точки зрения структурного анализа, структурная основа распознавания лигандов интегринами является, по большей части, еще малоизученной, и новые молекулярные «щупы» особенно ценны для таких исследований. Однако в этом аспекте еще есть пробелы из-за отсутствия конкретных ингибиторов. αvβ6 представляет собой рецептор фибронектина/тенасцина, специфичный для эпителия, который активируется во время воспалительных явлений, при пролиферации опухолей (разрастание ткани посредством деления клеток), и во время заживления ран. αvβ6 связан с миграцией и пролиферацией, экспрессией желатиназы и активацией TGF-β1. αIIbβ3, тромбоцитарный рецептор фибриногена участвующий в тромбозе; αvβ3 – рецептор для витронектина, который представляет собой многофункциональный гликопротеин плазмы крови и внеклеточного матрикса, фибронектина, фибриногена и других белков, активированных на эндотелии во время ангиогенеза опухоли и на клетках гладких мышц во время пролиферации; и αvβ5 – рецептор витронектина, участвующий в ангиогенезе ретинопатии [2]. Витронектин способен связывать глюкозаминогликаны, коллаген, плазминоген, рецептор урокиназы, ингибитор активатора плазминогена-1 и др. Также, витронектин связывается с гепарином и комплексом тромбин-антитробмин III, участвуя в фибринолизе и формировании иммунного ответа. Как и GRGDSP, витронектин содержит последовательность RGD и является субстратом, обеспечивающего адгезию, распластывание и миграцию клеток.

Фрагмент RGD – это часто встречающаяся последовательность распознавания, обнаруживаемая в составе белков внеклеточного матрикса и патогенных бактерий, которая играет ключевую роль в связывания с интегринами [2]. RGD обуславливает межклеточные контакты и адгезию. Распознавание последовательности RGD в молекуле находится в значительной зависимости от пространственного расположения Asp и Arg. Конформационно ограниченные RGD-пептиды проявляют высокое сродство к интегринам [3]. Пептиды RGD обладают прекрасным потенциалом применения в регенерации тканей, таргетной терапии на основе нацеливания на опухоль, биологической адгезии и др. направлениях. RGD-пептиды способствует специфическому прикреплению биоматериала к животным клеткам, экспрессирующим рецепторы интегрина, из-за его высокой аффинности (сродству) к этим рецепторам. Эффективность пептидов RGD подтверждена многими исследованиями in vitro, но некоторые исследования на животных были менее коррелированы с результатами in vitro. Многие факторы, такие как плотность и структура различных мотивов RGD и физико-химические свойства биоматериалов, могут влиять на эффективность RGD и будут полезны для объяснения этих, казалось бы, несовместимых результатов. Тем не менее, существует множество доклинических исследований для применений различных RGD-пептидов, показывающих его высокую эффективность специфического связывания с клетками, экспрессирующими рецепторы интегрина [4]. Следовательно, ожидается, что использование RGD-пептидов в целевой наномедицине в ближайшем будущем приведет к значительному прогрессу в доклинических и клинических исследованиях.

Так, например, разработана новая стратегия прививки пептида RGD на поверхности биоматериалов для эндотелизации сосудистых трансплантатов малого диаметра и кровеносных сосудов для тканевой инженерии. Пептид GRGDSP был привит на поверхности поликарбонатуретана [5]. Необходимость в улучшенных кровеносных сосудах малого диаметра (<6 мм) является критической вследствие увеличения числа проводимых операций по замене сосудов, поскольку у многих пациентов не хватает здоровых сосудов для применения аутотрансплантата (обычно – внутренней молочной артерии или подкожной вены) при создании обходных каналов. Таким образом, должны быть использованы искусственные сосудистые трансплантаты.Однако, последние имеют ряд ограничений: материалы, применяемые для трансплантатов малого диаметра, например, для шунтирования коронарной артерии, были, в основном, неэффективны из-за быстрой окклюзии, вызванной тромбозом и гиперплазией интимы. Чтобы преодолеть эти проблемы, были исследованы многочисленные стратегии улучшения работы сосудистых трансплантатов малого диаметра, включая эндотелизацию поверхности этих биоматериалов путем тканевой инженерии и химической модификации. Пептиды были успешно привиты на поверхности поликарбонатуретана, и ученые исследовали влияние этих модифицированных поверхностей на адгезию и пролиферацию эндотелиальных клеток [5]. Результаты продемонстрировали, что пептиды GRGDSP, привитые на поверхности полимеров, могут быть эффективным решением при изготовлении искусственных кровеносных сосудов малого диаметра. Ожидается, что модифицированный полимер будет использоваться для сосудистых трансплантатов с малым диаметром и функциональных тканевых кровеносных сосудов для улучшения адгезии и удержания эндотелиальных клеток на поверхностях полимера в условиях переменной силы потока [5]. Эти результаты показывают, что пептиды GRGDSP могут значительно увеличить удержание эндотелиальных клеток (92% удержанных клеток против 1% на немодифицированном полимере), что открывает широкие перспективы для использования таких привитых полимеров в создании сердечно-сосудистых имплантов (имплантатов).

Применимость пептидов, в частности – GRGDSP, в области разработки имплантов обусловлена их амфифильностью, т.е. присущим этим молекулам гидрофильными и гидрофобными свойствам одновременно, что позволяет им взаимодействовать как с гидрофобной поверхностью полимера, так и с гидрофильными структурными фрагментами клеток, например, гидрофильными головками фосфолипидов.

Иммобилизация пептидов, полученных из фактора роста фибронектина и фактора 2 фибробластов, на поверхности для культивирования способствует прикреплению и пролиферации плюрипотентных стволовых клеток человека (клеток, которые могут дифференцироваться в любые клетки, кроме клеток внезародышевых органов). Введение фрагмента GRGDSP в пептид PHSRN-GRGDSP и прививание его на поверхность культивационного сосуда с помощью адгезивного белка значительно улучшало адгезию, повышал активность щелочной фосфатазы и увеличивал экспрессию связанных с плюрипотентностью генов в клетках по сравнению с Matrigel, что может дать возможность культивирования без добавления факторов роста. GRGDSP обеспечил увеличение пролиферации на ~17%, а в составе пептида PHSRN-GRGDSP – до 45% [6]. Результаты дают новую возможность для эффективного культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека и могут быть использованы в клинических применениях в будущем.

Интересно, что пептиды, содержащие мотив RGD, вызывают апоптоз в покоящихся клетках. Напротив, как было показано на кардиомиоцитах крысы, привитый RGD-содержащий пептид (GRGDSP) не приводит к апоптозу. При этом, добавление растворимого GRGDSP вызывало апоптоз [7]. Эти результаты, с одной стороны, показали, что пептиды RGD должны проникать в клетки, чтобы вызвать апоптоз, с другой – объясняют применимость RGD-пептидов в вышеописанных областях.

Важным является действие RGD-пептидов на раковые клетки. В экспериментах, приведенных в работе [8], авторы использовали четыре различных трансплантируемых опухоли мыши: рак легкого Льюиса, меланома B16-F10, саркома ретикулума и рак мочевого пузыря MB-49, а также клеточную культуру меланомы B1 6-F10. Ряд соединения, включая GRGDSP, были проанализированы на их способность ингибировать прикрепление опухолевых клеток in vitro. Пептид GRGDSP полностью ингибировал прикрепление опухолевых клеток и клеток меланомы в концентрации 1 мг/мл. Важно, что растворы, содержащие GRGDSP, также ингибировали имплантацию опухолевых клеток in vivo на мышах. Из-за отсутствия токсичности могут использоваться гораздо более высокие концентрации RGD-пептидов. RGD-пептиды могут уменьшать экспериментальные гематогенные метастазы, предположительно, предотвращая прикрепление переносимых кровью клеток к легочному капиллярному внеклеточному матриксу. GRGDSP, который обратимо ингибировал прикрепление опухолевых клеток in vitro, также уменьшал вероятность развития опухоли в ране, загрязненной опухолевыми клетками, вносимым на хирургических инструментах. Когда опухоли все же развивались после орошения раны исследуемым соединением, их появление было отсрочено, и скорость роста была подавлена [8]. Ингибирование имплантации опухолевых клеток может принести большую пользу пациентам с локализованным опухолевым заболеванием, подвергающимся локальной резекции.

Интересно, что блокирование интегринов пептидом GRGDSP (500 мкг/мл) сильно уменьшает количество прилипших клеток (в 2,5 раза) и полностью ингибирует распространения клеток PC-3 рака предстательной железы (рак простаты) in vitro и изменения формы клетки, что подтверждает ключевую роль взаимодействия между интегринами и доменом FN III-10 в этих процессах [9].

По противоадгезивной активности, но в большей дозировке, GRGDSP сопоставим с сальмосином [10], который является пептидом, полученным из яда корейской змеи Agkistrodon haly’s brevicaudus, также содержащим последовательность RGD и проявляющим противоопухолевую активность [11].

Селективная активация свертывания крови в опухолевых сосудах, с последующим инфарктом опухоли, считается перспективной противоопухолевой стратегией. Гибридный белок tTF-RGD, состоящий из внеклеточного домена тканевого фактора [усеченного тканевого фактора (tTF)] и пептида GRGDSP, избирательно нацелен на αv-интегрины на опухолевых эндотелиальных клетках. tTF-RGD сохраняет свою тромбогенную и интегрин-связывающую активность in vitro. Исследования in vivo на мышах с аденокарциномами человека (CCL185), меланомой (M21) и фибросаркомой (HT1080) показали, что внутривенное введение tTF-RGD индуцировало тромботическую окклюзию опухолевых сосудов, приводя к замедлению роста или регрессии опухолей во всех трех типах солидных опухолей без видимых побочных эффектов, таких как тромбоз в других органах [12]. RGD-пептид-направленная доставка tTF может стать многообещающей стратегией для лечения рака.

Экспериментальное исследование возможности уменьшения опухоли при прогрессировании и рецидиве гепатоцеллюлярной карциномы посредством комбинации трансартериального введения наночастиц, нагруженных GRGDSP (дозировка – 0,25 мг), плюс трансартериальной химиоэмболизации (TACE) на животной модели опухоли печени на крысах [13]. Данные показали, что введение введения GRGDSP-наночастиц и интервенционное лечение является безопасной и более эффективной терапией по сравнению с TACE (в 1,6 раз) или TACE+GRGDSP (в 2,6 раза), что определялось по увеличению размера опухоли и подавлению метастазирования. Комбинированная мультимодальная таргетная терапия демонстрирует огромные преимущества по сравнению с традиционной интервенционной терапией.

Таким образом, очевидно, что пептид GRGDSP обладает широким спектром полезной биологической активности. Наиболее ценными можно считать его противоопухолевое, противометастатическое действие и полезность в создании искусственных сосудистых трансплантатов. Описанный пептид требует дальнейших исследований в указанных направления.

Дополнительно:

1.         UniProtKB – P02751 (FINC_HUMAN). 2020; Available from: https://www.uniprot.org/uniprot/P02751.

2.         Goodman, S.L., Hölzemann, G., Sulyok, G.A.G., Kessler, H., Nanomolar Small Molecule Inhibitors for αvβ6, αvβ5, and αvβ3 Integrins. Journal of Medicinal Chemistry, 2002. 45(5): p. 1045-1051. DOI: 10.1021/jm0102598.

3.         Sewald, N., Jakubke, H.-D., Peptides from A to Z. A Concise Encyclopedia. 2008, Darmstadt: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. p. 400.

4.         Alipour, M., Baneshi, M., Hosseinkhani, S., Mahmoudi, R., Jabari Arabzadeh, A., Akrami, M., Mehrzad, J., Bardania, H., Recent progress in biomedical applications of RGD-based ligand: From precise cancer theranostics to biomaterial engineering: A systematic review. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2020. 108(4): p. 839-850. DOI: 10.1002/jbm.a.36862.

5.         Li, J., Ding, M., Fu, Q., Tan, H., Xie, X., Zhong, Y., A novel strategy to graft RGD peptide on biomaterials surfaces for endothelization of small-diamater vascular grafts and tissue engineering blood vessel. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 2008. 19(7): p. 2595-2603. DOI: 10.1007/s10856-007-3354-5.

6.         Dayem, A.A., Won, J., Goo, H.-G., Yang, G.-M., Seo, D.S., Jeon, B.-M., Choi, H.Y., Park, S.E., Lim, K.M., Jang, S.-H., Lee, S.B., Choi, S.B., Kim, K., Kang, G.-H., Yeon, G.-B., Kim, D.-S., Cho, S.-G., The immobilization of fibronectin- and fibroblast growth factor 2-derived peptides on a culture plate supports the attachment and proliferation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Research, 2020. 43: p. 101700. DOI: 10.1016/j.scr.2020.101700.

7.         Adderley, S.R., Fitzgerald, D.J., Glycoprotein IIb/IIIa Antagonists Induce Apoptosis in Rat Cardiomyocytes by Caspase-3 Activation. 2000. 275(8): p. 5760-5766. DOI: 10.1074/jbc.275.8.5760.

8.         Whalen, G.F., Ingber, D.E., Inhibition of tumor-cell attachment to extracellular matrix as a method for preventing tumor recurrence in a surgical wound. Ann Surg, 1989. 210(6): p. 758-764. DOI: 10.1097/00000658-198912000-00011.

9.         Stachurska, A., Elbanowski, J., Kowalczyńska, H.M., Role of α5β1 and αvβ3 integrins in relation to adhesion and spreading dynamics of prostate cancer cells interacting with fibronectin under in vitro conditions. Cell Biology International, 2012. 36(10): p. 883-892. DOI: 10.1042/CBI20110522.

10.       US 6537551 B2 2003.

11.       Kang, I.-C., Lee, Y.-D., Kim, D.-S., A Novel Disintegrin Salmosin Inhibits Tumor Angiogenesis. Cancer Research, 1999. 59(15): p. 3754.

12.       Kessler, T., Bieker, R., Padró, T., Schwöppe, C., Persigehl, T., Bremer, C., Kreuter, M., Berdel, W.E., Mesters, R.M., Inhibition of Tumor Growth by RGD Peptide–Directed Delivery of Truncated Tissue Factor to the Tumor Vasculature. Clinical Cancer Research, 2005. 11(17): p. 6317. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-05-0389.

13.       Qian, J., Oppermann, E., Tran, A., Imlau, U., Qian, K., Vogl, T.J., Transarterial administration of integrin inhibitor loaded nanoparticles combined with transarterial chemoembolization for treating hepatocellular carcinoma in a rat model. World journal of gastroenterology, 2016. 22(21): p. 5042-5049. DOI: 10.3748/wjg.v22.i21.5042.