Тимозин-β4 или TB-500. Большой обзор

Ингибитор интегрина GRGDSP
24.02.2020
Неоантигены и пептидная вакцина. Персонализированная иммунотерапия рака
29.02.2020

Тимозин-β4 (Тимозин бета 4, TB-500, Tβ4, Thymosin beta 4, Thymosin-β4, ТВ-4, Timbetasin, RGN-352, RGN-259; CAS 7591-33-4, 77642-24-1) – представляет собой природный ацетилированный тритетраконтапептид с гормоноподобными свойствами. Тимозину-β4 соответствует следующая аминокислотная последовательность из 43 остатков:

Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-OH     (Ac-SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES)

Пептид имеет молекулярную массу 4982 Да, pI 5.1 и характеризуется хорошей растворимостью в водных средах.

Данный биологически активный пептид присутствует во фракциях 5 и 5А тимозина, вырабатываемого вилочковой железой (тимусом), а также может быть получен химическими методами с помощью твердофазного синтеза [1, 2].

Тимус (вилочковая железа) является важным органом, в котором происходит образование лимфоцитов, включая созревание, дифференцировку, позитивную и негативную селекцию T-клеток [3]. Такие клетки выполняют ключевую функцию в приобретенном иммунитете человека. Нарушения работы тимуса, врожденные или приобретенные, вызывают снижение иммунитета из-за снижения содержания Т-клеток в крови. Другая, не менее значимая, роль тимуса – это выработка множества полипептидных гормонов, включая тимозин, инсулиноподобный фактор роста-1, тимулин и другие. История изучения биологической активности экстрактов тимуса длится с 1896 года [3].

Полипептиды тимозины первоначально были выделены из тканей позвоночных в 1966 году и определены как выполняющие гормональные или иммуномодулирующие функции [3]. Обозначение «тимозины» связано с первым выделением компонентов из препаратов ткани тимуса. α- и β-тимозины являются основными членами этого семейства пептидов. Термин β-тимозин ограничен группой гомологичных пептидов со средним значением Mr 5 кДа. У млекопитающих наиболее часто встречающимся членом этой группы является тимозин-β4, наряду с Tβ10, в случае человека. Однако тимозин-β4 присутствуют в гораздо более высоких концентрациях в тромбоцитах крови и в тканях вне вилочковой железы. Концентрация пептида в клетках может достигать 0,5 мМ. Было показано, что тимозин-β4 активен в различных биологических исследованиях и, например, индуцирует терминальную активность дезоксинуклеотидилтрансферазы in vivo и in vitro и стимулирует секрецию люлиберина гипоталамусом [4]. Биологические эффекты, проявляемые тимозином-β4 в индивидуальном виде, известны с 1981 года, когда пептид был первоначально выделен из фракции 5 тимозина комбинацией колоночной хроматографии и гель-фильтрации [3].

Тимозин-β4 взаимодействует с комплексом G-актин-АТФ в стехиометрии 1:1; т.е., одна единица тимозина β-4 связывается с одной единицей G-актина [5]. Роль такого комплекса заключается в том, чтобы препятствовать включению мономеров актина в растущий полимер, задерживая тем самым его полимеризацию и играя важную роль в регуляции полимеризации актина во многих клетках [6]. Кроме того, получаемая структура является ферментативным каталитическим центром, к которому присоединяются АТФ и Mg2+, и где АТФ подвергается гидролизу до АДФ. Актины способствуют образованию клеточного каркаса (цитоскелета), делению клеток (пролиферации), участвуют в изменении формы клетки и клеточном движении (цитокинезе). В клетках мышц актин образует комплекс с миозином, участвующий в их сокращении, а в немышечных – принимает участие в транспортировке везикул и органелл [7]. Тимозин-β4, как показано в Таблице 1, способствует регенерации тканей, проявляет противовоспалительные свойства, активирует образование и рост сосудов (ангиогенез), влияет на дифференциацию стволовых клеток [3, 8-10]. Исследования выявили, что актин-связывающий домен LKKTET молекулы тимозина-β4 является ключевым для его ангиогенной активности. Ac-SDKP обычно блокирует воспаление и уменьшает фиброз, а другой активный сайт на N-конце, содержащий 15 аминокислотных остатков, включая Ac-SDKP, способствует выживанию клеток и блокирует апоптоз [9].

Таблица 1 – Биологическая активность тимозина-β4

In vitro In vivo
• Ингибирование полимеризации актина
• Ускорение заживления ран
• Индукция активности терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) в TdT-отрицательных клетках костного мозга
• Ингибирование миграции макрофагов
• Снижение содержания F-актина (стрессовых волокон) после микроинъекции в клетки
• Снижение содержания F-актина в мокроте при муковисцидозе
• Стимуляция прорастания аортального кольца и ангиогенеза
• Хемотаксические свойства (двигательная реакция на химический раздражитель)
• Стимулирует производство фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), активина TGF-β, ламинина-5 и зиксина • Стимулирует миграцию эпителиальных клеток конъюнктивы
• Увеличение ангиогенеза
• Усиление миграции: эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки, стволовые клетки, кератиноциты
• Увеличение выживаемости клеток
• Ускорение дифференцировки: эндотелиальные клетки, стволовые клетки
• Ускорение роста опухолей
• Стимуляция гипофизарной секреции гонадолиберина (LRH) и лютеинизирующего гормона
• Стимуляция выделения LRH из гипоталамуса.  
• Снижает токсичность химиотерапии у мышей
• Ускоряет заживление роговицы у мышей, крыс после ожогов щелочью или гептанолом
• Подавляет воспалительные цитокины и хемокины, такие как интерлейкины IL-1α, IL-18, белоки-хемоатрактанты макрофагов MIP-1α, MIP-1β и макрофагальные белки воспаления MCP-1
• Уменьшает тяжесть септического шока
• Стимулирует ангиогенез у мышей и крыс.
• Ускоряет заживление ран у нормальных мышей и мышей с иммунодефицитом
• Повышенное заживление кожи
• Ускоряет заживление ран у пожилых мышей и db/db-мышей с диабетом
• Увеличение роста волос
• Противовоспалительное
• Увеличение ангиогенеза
• Индукция активности TdT в TdT-негативных клетках
• Повышает активность TdT у мышей с иммуносупрессией гидрокортизоном

Неудивительно, что, при таком широком спектре потенциально полезных активностей, тимозин-β4 привлекает пристальное внимание как разработчиков лекарственных препаратов, так и коммерческие структуры, работающие в сфере косметической химии, поскольку противовоспалительные эффекты, ускорение заживления ран и регенерации тканей является ключевыми в восстановлении различных мышц, включаю сердечную, и в антивозрастных подходах, например, для стимуляции роста волос. На данный момент, в базе данных ClinicalTrials.gov содержится 11 клинических испытаний в фазах 1–3 тимозина-β4, из которых завершено 6.

Из наиболее жизненно важных свойств, необходимо отметить влияние тимозина-β4 на сердечно-сосудистую систему, поскольку болезни сердца являются основной причиной смерти у новорожденных детей и у взрослых. Известно, что пептид активирует интегрин-связанную киназу (ILK) и способствует миграции, выживанию и восстановлению клеток сердца, что было продемонстрировано на клеточной культуре эмбриональных и постнатальных кардиомиоцитов – выживаемость клеток была улучшена. Также, в экспериментах in vivo после перевязки коронарной артерии у мышей, обработка тимозином-β4 приводила к положительной регуляции активности ILK и протеинкиназы B (Akt) в сердце, увеличивала выживаемость ранних миоцитов и улучшала сердечную функцию [11]. Тимозин-β4 облегчает эпикардиальную неоваскуляризацию как поврежденного взрослого сердца млекопитающего, так и здорового, что было показано на мышиной модели in vivo [12]. Тимозин-β4 значительно улучшил долговременное восстановление неврологических функций на модели инсульта у крыс в дозе 2 и 12 мг/кг на 14-й день и увеличился до 56-го дня после обструкции средней мозговой артерии [13]. Оптимальная расчетная доза составила 3,75 мг/кг. Тимозин-β4 увеличивал пролиферацию в субвентрикулярной зоне и в белом веществе мозолистого тела, а также способствовал миелинизации в уязвимой ишемической границе пласта.

Эти результаты предполагают, что тимозин-β4 может иметь значительный терапевтический потенциал у людей для защиты миокарда и содействия выживанию кардиомиоцитов на острых стадиях ишемической болезни сердца. Уже к 2007 году было проведено более 15 исследований на животных, включая приматов, по фармакологии и токсикологии тимозина-β4 в различных лекарственных формах и была показана его хорошая переносимость и низкая токсичность [14]. Компания RegeneRx Biopharmaceuticals, Inc. исследовала пептид в концентрации 100 мг/мл при внутривенном введении с различными дозировками (до 1260 мг одной дозой) для лечения пациентов с острым инфарктом миокарда (ОИМ), согласно клиническому протоколу фазы 1 и 2 (NCT00743769 и NCT01311518) оценки безопасности, переносимости и фармакокинетики у здоровых добровольцев и у пациентов с ОИМ [14]. Исследование (NCT01311518) фазы 2 в дозах 1200 мг или 450 мг включало в себя внутривенное струйное болюсное введение (быстрое введение, в отличие от медленного, инфузионного) ежедневно в течение 3 дней, затем еженедельно в течение 4 последовательных недель. Препарат показал себя как легко переносимый и безопасный [15], однако испытания (NCT00743769 и NCT01311518) были прерваны, причины не известны. Наличием множества данных, полученных на животных моделях и in vitro, говорящих об эффективности тимозина-β4 при повреждениях сердечно-сосудистой и периферической нервной системы все еще оставляют надежду на успех препарата применительно к человеку при его должной концентрации или в комбинации с другими лекарствами [10, 16].

Несмотря на это, тимозин-β4 прошел клинические испытания фазы 2 и 3, проведенными той же фирмой – RegeneRx (NCT00382174), по применению на 54 пациентах (18–85 лет) с пролежнями при местном нанесении в виде геля в дозировке 0,01, 0,02 и 0,1% против плацебо. Через 84 дня 11 пациентов, получавших пептид, излечились полностью против 3 в контрольной группе. В практически аналогичном исследовании (NCT00832091) у пациентов с трофическими язвами вен через 99 дней излечилось 12 против 4 в контрольной группе. Два независимых клинических исследования фазы 2 оценивали безопасность и эффективность геля при лечении 143 пациентов с хроническими кожными пролежневыми язвами (III/IV) и венозными трофическими язвами, у большинства пациентов имелось варикозное расширение вен и открытое изъязвление. Скорость заживления у пациентов, получавших среднюю дозу (0,02%), была примерно на один месяц быстрее, чем у получавших плацебо или другие дозы тимозина-β4 [17].

Еще более успешными оказались испытания офтальмологических растворов с содержанием тимозина-β4 0,1% для лечения признаков и симптомов сухости глаз (NCT00832091, NCT02974907), проведенные компанией ReGenTree, LLC. В исследовании фазы 2 было показано, что пептид значительно улучшает признаки и симптомы тяжелой сухости глаз [18]. Девять пациентов получали лечение 0,1%-ым раствором 6 раз в день в течение 28 дней. На 56-й день в группе, получавшей тимозин-β4, наблюдалось снижение глазного дискомфорта на 35,1% и на 59,1% – снижение общего окрашивания флюоресцеином роговицы по сравнению с контролем. Другие улучшения, наблюдаемые у пациентов, включали продление времени разрушения слезной пленки и увеличение объема слезы. Препарат прошел 3 фазу на 317 пациентах, но результаты пока не опубликованы. В настоящее время проводится набор 700 добровольцев для продолжения исследований (NCT03937882 «ARISE-3»).

 Также, известна способность тимозина-β4 оказывать глубокое стимулирующее действие на волосы благодаря комбинированному действию на несколько критических событий в росте волосяного фолликула, таких как миграция стволовых клеток, производство ферментов, разрушающих внеклеточный матрикс, и дифференциация клеток, что было показано на различных крысиных и мышиных моделях in vivo и ex vivo [8]. У грызунов, которым наносили на поверхность кожи по 100 мкг тимозина-β4, количество активных фолликулов было на 12% больше, чем в контрольной группе. Позже была проведена серия работ по более детальному изучению этого явления. В работах [19, 20] на мышах с гиперэкспрессией тимозина-β4 in vivo наблюдалась активация роста волос после депиляции по сравнению с нормальными мышами. В экспериментах in vitro тимозин-β4 показал цитопротекторные свойства на дермальных фибробластах человека [9].

Ожидаемо, пептиды тимуса, включая тимозин-β4, тимулин и тимозин-α1 были предложены в качестве средств от алопеции (облысения), которые предотвращают выпадение волос путем ингибирования фазы катагена [21]. Фаза катагена примечательна тем, что в течение этого времени, которое длится около двух недель, волосяной фолликул сжимается из-за начала распада, а волосяной сосочек «отдыхает», отрезая волос от питающего его кровоснабжения. С другой стороны, есть данные, указывающие на то, что тимозин-β4 оказывает тонкое, но отчетливое влияние на выработку волосяного стержня человека in vitro, что авторы объясняют сокращением фазы анагена (фаза физического роста волоса) [22].

В 2018 году были опубликованы результаты открытого пилотного клинического исследования эффективности и безопасности состава для усиления роста волос человека, вводимого путем интрадермальных инъекций [24]. В исследуемый состав были включены тимозин-β4, сосудистый эндотелиальный фактор роста, основной фактор роста фибробластов, инсулиноподобный фактор роста, фактор роста кератиноцитов и медь-трипептид-1 (GHK-Cu). В исследовании приняли участие 1000 пациентов 20–60 лет с облысением по мужскому или женскому типу, которые не реагировали в течение года или более на местную терапию миноксидилом (2% в случае женщин и 5% – мужчин) и пероральный прием 1 мг финастерида (мужчины). Состав применяли в виде инъекции в кожу головы 1 раз в три недели, было проведено 8 сеансов, в каждом из которых вводили по 60–70 инъекций в местах истончения волос. По завершению исследования, значительное снижение выпадения волос наблюдалось у 83% пациентов, прошедших тест на выдергивание волос (Hair pull test); у ~75% – начался рост волос [24]. Средство оказалось безопасным, лишь 15% пациентов сообщили о легком зуде кожи головы, боль в процессе введения переносилась легко. Положительный эффект сохранялся после 1 года от окончания эксперимента.

Корейская компания OLIPASS Cosmeceuticals Company разработала косметическую композицию, содержащую инсулиноподобный фактор роста, олигопептид и от 1,17 до 67% тимозина-β4 (наиболее удачные составы содержат ~5–7%) [25]. Изобретение направлено на контроль секреции кожного сала кожей головы, создавая оптимальную среду для роста волос, и активирует факторы роста, способствующие укреплению и росту волос, и улучшая здоровье кожи головы. Авторы провели исследование на 50 добровольцах мужского и женского пола; наиболее удачный состав через 3 месяца применения значительно предотвращал потерю волос у 76% испытуемых [25]. Синтетический тимозин-β4 в составе липосом используется в средствах для улучшения роста волос и оздоровления кожи, производимых корейской фирмой Regaron [26].

Применение фракции 5 тимозина в составе средств для лечения алопеции, в целом, давно защищено патентам, например [27].

Несмотря на недостаточную изученность действия на организм человека тимозина-β4, также известного под названием TB-500 и предназначенного только для ветеринарного применения, сообщалось о его использовании в качестве допинга спортсменами, особенно атлетами [28-31]. Интересно, что поставщики препарата TB-500 для спортсменов рекомендуют дозировки, ссылаясь на работу по пересчету дозы, примененной в исследованиях на животных, для человека [32].

TB-500 – название ветеринарного препарата для лечения лошадей и верблюдов. Благодаря известным эффектам на животных (уменьшает воспаление, помогает заживлению ран и наращиванию мышц, а также ускоряет восстановление мышечных волокон и клеток), препарат нашел применение в качестве допинга для животных: для лошадей на скачках, а также в собачьих бегах [30]. Заявлялось, что некоторые из выдающихся дрессировщиков наблюдали огромное повышение производительности после использования этого препарата на своих животных. Несмотря на заверения недобросовестных поставщиков, содержание TB-500 контролируется в крови и моче лошадей даже при концентрации менее 50 пг/мл (5·10-11 г/мл) в плазме [33].

Анализ ряда коммерчески доступных образцов TB-500 показал, что значительная их часть обладала низкой степенью чистоты и содержала примесные компоненты. [29]. Использование тимозина-β4 и его производных профессиональными спортсменами запрещено Всемирным антидопинговых агентством [34].

Таким образом, тимозин-β4 является перспективным препаратом, особенно в области офтальмологии, сердечно-сосудистых патологиях, косметологии, как кожно-заживляющий агент, регенерации опорно-двигательного аппарата, в качестве компонента средств против алопеции и других. Другие полезные биологические эффекты пептида требуют дальнейших тщательных исследований. Широкий спектр биологической активности тимозина-β4 указывает на еще не полностью раскрытые возможности его применения.

Дополнительно:

1.         Low, T.L.K., Wang, S., Goldstein, A., Solid-phase synthesis of thymosin β4: Chemical and biological characterization of the synthetic peptide. Biochemistry, 1983. 22: p. 733-740.

2.         Wang, S.S., Wang, B.S.H., Chang, J.K., Low, T.L.K., Goldstein, A., Synthesis of thymosin B4. International Journal of Peptide and Protein Research, 2009. 18: p. 413-415. DOI: 10.1111/j.1399-3011.1981.tb03000.x.

3.         Goldstein, A.L., Badamchian, M., Thymosins: chemistry and biological properties in health and disease. Expert Opinion on Biological Therapy, 2004. 4(4): p. 559-573. DOI: 10.1517/14712598.4.4.559.

4.         Sewald, N., Jakubke, H.-D., Peptides from A to Z. A Concise Encyclopedia. 2008, Darmstadt: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. p. 400.

5.         Crockford, D., Turjman, N., Allan, C., Angel, J., Thymosin β4: structure, function, and biological properties supporting current and future clinical applications. Annals of the New York Academy of Sciences, 2010. 1194(1): p. 179-189. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2010.05492.x.

6.         Goldschmidt-Clermont, P.J., Furman, M.I., Wachsstock, D., Safer, D., Nachmias, V.T., Pollard, T.D., The control of actin nucleotide exchange by thymosin beta 4 and profilin. A potential regulatory mechanism for actin polymerization in cells. Molecular Biology of the Cell, 1992. 3(9): p. 1015-1024. DOI: 10.1091/mbc.3.9.1015.

7.         Бочкарева, Н.В., Кондакова, И.В., Коломиец, Л.А., Роль актинсвязывающих белков в клеточном движении в норме и при опухолевом росте. Молекулярная медицина, 2011(6): p. 14-18.

8.         Philp, D., St-Surin, S., Cha, H.-J., Moon, H.-S., Kleinman, H.K., Elkin, M., Thymosin Beta 4 Induces Hair Growth via Stem Cell Migration and Differentiation. Annals of the New York Academy of Sciences, 2007. 1112(1): p. 95-103. DOI: 10.1196/annals.1415.009.

9.         Sosne, G., Qiu, P., Goldstein, A.L., Wheater, M., Biological activities of thymosin β4 defined by active sites in short peptide sequences. The FASEB Journal, 2010. 24(7): p. 2144-2151. DOI: 10.1096/fj.09-142307.

10.       Kobayashi, H., Yu, Y., Volk, D.E., Chapter 13 – Thymosins, in Hormonal Signaling in Biology and Medicine, G. Litwack, Editor. 2020, Academic Press. p. 311-326.

11.       Bock-Marquette, I., Saxena, A., White, M.D., Michael DiMaio, J., Srivastava, D., Thymosin β4 activates integrin-linked kinase and promotes cardiac cell migration, survival and cardiac repair. Nature, 2004. 432(7016): p. 466-472. DOI: 10.1038/nature03000.

12.       Smart, N., Risebro, C.A., Clark, J.E., Ehler, E., Miquerol, L., Rossdeutsch, A., Marber, M.S., Riley, P.R., Thymosin β4 facilitates epicardial neovascularization of the injured adult heart. Annals of the New York Academy of Sciences, 2010. 1194(1): p. 97-104. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2010.05478.x.

13.       Morris, D.C., Zhang, Z.G., Zhang, J., Xiong, Y., Zhang, L., Chopp, M., Treatment of neurological injury with thymosin β4. Annals of the New York Academy of Sciences, 2012. 1269(1): p. 110-116. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2012.06651.x.

14.       Crockford, D., Development of Thymosin β4 for Treatment of Patients with Ischemic Heart Disease. Annals of the New York Academy of Sciences, 2007. 1112(1): p. 385-395. DOI: 10.1196/annals.1415.051.

15.       Ruff, D., Crockford, D., Girardi, G., Zhang, Y., A randomized, placebo-controlled, single and multiple dose study of intravenous thymosin β4 in healthy volunteers. Annals of the New York Academy of Sciences, 2010. 1194(1): p. 223-229. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2010.05474.x.

16.       Bjorklund, G., Dadar, M., Aaseth, J., Chirumbolo, S., Thymosin beta4: a multi-faceted tissue repair stimulating protein in heart injury. Current medicinal chemistry, 2019. DOI: 10.2174/0929867326666190716125456.

17.       Treadwell, T., Kleinman, H.K., Crockford, D., Hardy, M.A., Guarnera, G.T., Goldstein, A.L., The regenerative peptide thymosin β4 accelerates the rate of dermal healing in preclinical animal models and in patients. Annals of the New York Academy of Sciences, 2012. 1270(1): p. 37-44. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2012.06717.x.

18.       Sosne, G., Dunn, S.P., Kim, C., Thymosin β4 Significantly Improves Signs and Symptoms of Severe Dry Eye in a Phase 2 Randomized Trial. Cornea, 2015. 34(5).

19.       Gao, X., Liang, H., Hou, F., Zhang, Z., Nuo, M., Guo, X., Liu, D., Thymosin Beta-4 Induces Mouse Hair Growth. PloS one, 2015. 10(6): p. e0130040-e0130040. DOI: 10.1371/journal.pone.0130040.

20.       Gao, X.-y., Hou, F., Zhang, Z.-p., Nuo, M.-t., Liang, H., Cang, M., Wang, Z.-g., Wang, X., Xu, T., Yan, L.-y., Guo, X.-d., Liu, D.-j., Role of thymosin beta 4 in hair growth. Molecular Genetics and Genomics, 2016. 291(4): p. 1639-1646. DOI: 10.1007/s00438-016-1207-y.

21.       US 20110281802 A1, 2011.

22.       Meier, N., Langan, D., Hilbig, H., Bodó, E., Farjo, N.P., Farjo, B., Armbruster, F.P., Paus, R., Thymic peptides differentially modulate human hair follicle growth. The Journal of investigative dermatology, 2012. 132(5): p. 1516.

23.       WO 2017210726 A1, 2017.

24.       Kapoor, R., Shome, D., Intradermal injections of a hair growth factor formulation for enhancement of human hair regrowth – safety and efficacy evaluation in a first-in-man pilot clinical study. Journal of Cosmetic and Laser Therapy, 2018. 20(6): p. 369-379. DOI: 10.1080/14764172.2018.1439965.

25.       US 20170340544 A1, 2017.

26.       Oh, D., Reverse-Aging Biotechnology. 2018, Regeron, Inc: South Korea.

27.       EP 1039874 B1, 2000.

28.       Thevis, M., Schänzer, W., Analytical approaches for the detection of emerging therapeutics and non-approved drugs in human doping controls. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014. 101: p. 66-83. DOI: 10.1016/j.jpba.2014.05.020.

29.       Зверева, И., Семенистая, Е., Кротов, Г., Родченков, Г., Идентификация допинговых соединений пептидной природы, распространяемых через интернет. Аналитика, 2014(3): p. 58-70.

30.       Esposito, S., Doping control analysis of small peptide hormones.  PhD.  2015. Doping Control Laboratory, Department of Clinical Chemistry, Microbiology and Immunology,  Ghent University: Gent, Belgium. p. 256.

31.       Venhuis, B.J., Keizers, P.H.J., Klausmann, R., Hegger, I., Operation resistance: A snapshot of falsified antibiotics and biopharmaceutical injectables in Europe. Drug Testing and Analysis, 2016. 8(3-4): p. 398-401. DOI: 10.1002/dta.1888.

32.       Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N., Dose translation from animal to human studies revisited. The FASEB Journal, 2007. 22(3): p. 659-661. DOI: 10.1096/fj.07-9574LSF.

33.       Kwok, W.H., Ho, E.N.M., Lau, M.Y., Leung, G.N.W., Wong, A.S.Y., Wan, T.S.M., Doping control analysis of seven bioactive peptides in horse plasma by liquid chromatography–mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013. 405(8): p. 2595-2606. DOI: 10.1007/s00216-012-6697-9.

34.       Agency, W.A.-D., The World Anti-Doping Code International Standard. Prohibited List. 2018.