Рекомбинантный гормон роста (GH) применяют для лечения дефицита гормона роста с 1980-х гг. Препарат требует ежедневного подкожного введения, что создает неудобства пациентам и подталкивает исследователей к разработке усовершенствованных препаратов GH пролонгированного действия. Для создания лекарства, которое быстро всасывается в кровоток после подкожного введения, но медленно выводится из кровеносной системы, используется несколько стратегий. Они позволяют создавать: 1) ПЭГилированные препараты, 2) пролекарства, которые превращаются в активный препарат, 3) ковалентные соединения GH с альбумином и 4) продукты слияния белков или пептидов с GH. В данном обзоре приведено краткое описание подходов, используемых для получения GH пролонгированного действия, а также рассмотрены некоторые примеры экспериментальных препаратов.

Гипофизарный гормон роста (соматропин, соматотропин, hGH, РГЧ) был единственным способом лечения детей с дефицитом гормона роста (ДГР) до 1985 г., когда для клинического применения стал доступен рекомбинантный GH [1]. К настоящему времени описаны способы экспрессии и очистки GH как из прокариотических, например E. coli, так и из эукариотических клеток-хозяев (дрожжи P. pastoris и S. cerevisiae, клетки животного происхождения).

Гормон роста человека hGH массой 22 кДа состоит из 191 аминокислоты с двумя внутримолекулярными дисульфидными связями Cys53-Cys165 и Cys182-Cys189 [2, 3]. Один лиганд hGH связывается с двумя молекулами рецепторов, т.к. молекула hGH содержит два разных сайта связывания. Дисульфидный мостик между Cys53 и Cys165 обеспечивает связь между спиралями I и II и спиралью IV. Второй дисульфидный мостик образует небольшую петлю в С-конце [4]. Оба дисульфидных мостика важны для сохранения трехмерной структуры и стабильности белков. Удаление дисульфидного мостика Cys53-Cys165 снижает стабильность белка и связывание с рецептором GHR. Гормон характеризуется коротким периодом полувыведения из циркуляции, ~20 мин, что связано с почечным клиренсом.

Лечение ДГР у взрослых и детей проводится с помощью заместительной терапии GH. Вплоть до настоящего времени для этого используются ежедневные инъекции rhGH, но частота введений устраивает не всех пациентов [1]. Разработки лекарства с пролонгированным действием начались еще в конце 1970-х годов. Так, в работе [5] описано применение геля GH (15%) внутримышечно два раза в неделю в качестве депо-препарата, при этом результаты по скорости роста были схожими по сравнению с применением стандартного водного раствора GH в течение 1-го года. Однако на 2-м году было отмечено ослабление эффекта скорости роста, даже после корректировки дозировки по массе тела. В последние годы ученым удалось во многом преодолеть существующие препятствия.

В данном обзоре обобщены подходы, которые использовались для получения агонистов GHR длительного действия в лабораторных и клинических условиях.

Создание терапевтических препаратов длительного действия на основе GH

Короткий период полувыведения из циркуляции — существенный недостаток гормона роста. Для преодоления этого препятствия используется ряд стратегий, включая гликозилирование, слияние белков, конъюгацию с альбумином, создание конъюгатов на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ), которые увеличивают молекулярную массу и гидродинамический объем, препятствуя тем самым выведению биомолекул через почки. В результате исследований появилось множество ПЭГилированных производных, в т.ч. одобренных FDA. ПЭГилирование может осуществляться с помощью химических и ферментативных методов присоединения фрагментов ПЭГ к белкам по тиоловой группе цистеина, карбоксиамидной группе глутамина, ε-аминогруппе лизина или спиртовой группе серина и треонина (Рис. 1). Однако ПЭГилирование может приводить к снижению связывания с рецептором и, как следствие, активности из-за стерических затруднений. Это явление компенсируется увеличением его периода полувыведения из циркуляции. Таким образом, если большинство подходов к разработке лекарственных средств направлены на то, чтобы специально повысить активность препарата, то при разработке ПЭГилированных производных основное внимание уделяется балансу фармакокинетических и фармакодинамических свойств для получения лекарств с большим временем присутствия в системах организм. Способ введения цепи ПЭГ, а также место присоединения имеют принципиальное значение, поскольку ПЭГ может стерически нарушать процесс распознавания белка рецептором. Далее мы рассмотрим стратегии создания препаратов GH длительного действия, а также обсудим последние достижения в этой области.

Рисунок 1 — Обобщенные стратегии ПЭГилирования для модификации аминокислотной последовательности человеческого гормона роста (hGH) с указанием мест конъюгации с ПЭГ [3]

ПЭГилирование для получения гормона роста пролонгированного действия

Для ПЭГилирования GH использовались различные химические подходы, которые имеют свои преимущества и недостатки. Например, N-гидроксисукцинимидные (NHS) эфиры ПЭГ вступают в реакцию с аминами белка. Эти полимеры коммерчески доступны, однако их недостатком является отсутствие сайт-специфичности и быстрый гидролиз NHS-группы. В последнем случае обычно требуется большой избыток ПЭГ, который необходимо удалять из продукта. Образующаяся связь обеспечивает стабильный амид. ПЭГ с альдегидной группой использовался для реакции с аминами. Альдегиды менее склонны к гидролизу, чем NHS-группы. Но образующийся имин нестабилен, поэтому связь должна быть восстановлена до стабильного амина. Малеимидные ПЭГ также используются для реакции с тиоловыми группами. Эти группы в растворе более стабильны, чем NHS, а реакция протекает специфично со свободными цистеинами. Недостатком является то, что образующаяся тиоловая эфирная группа подвергается инверсии конфигурации в физиологических условиях, что может изменить фармакокинетический профиль. Полимеры с азидными или алкильными группами используются в реакциях «клик-химии». Эти химические реакции региоселективны, а ПЭГ и продукты стабильны в растворе. Но подходящая реакционноспособная группа отсутствует в нативном белке GH. Кроме того, если не использовать напряженные алкины, то для реакции требуется медный катализатор, который может быть повреждать некоторые белки.

Распространенным подходом к ПЭГилированию белков является неспецифическое присоединение к аминогруппам с помощью, например, NHS. Как описано выше, несмотря на то что этот метод дает более высокий выход конъюгатов при использовании коммерчески доступных реагентов, его неспецифичность часто приводит к нарушению связывания белка с лигандом из-за стерических помех. Кроме того, конъюгаты, полученные этим методом, гетерогенны, что создает проблемы с определением характеристик и воспроизводимостью. Для увеличения периода полувыведения циркулирующего GH в 1996 году исследователи получили производные GH, содержащие до семи ПЭГ-цепочек длиной 5 кДа [6]. Разделение с разной степени ПЭГилированных производных является сложной задачей. Чтобы преодолеть эту проблему, для очистки продуктов авторы использовали набор хроматографических методов, включая высокоэффективную хроматографию на сефарозе и ВЭЖХ. В результате была получена серия очищенных конъюгатов GH(PEG)₂, GH-(PEG)₅ и GH-(PEG)₇, чистота которых составила 85%. Увеличение степени модификации ПЭГ линейно снижало сродство hGH к рецептору. Эффективность аналогов была оптимальной для hGH, конъюгированного с 5 экв. ПЭГ5000, причем она, как показано на крысах, возрастала примерно в 10 раз по сравнению с немодифицированным hGH. Однако очищенные производные GH-PEG оказались модифицированы по разным аминокислотным участкам, что объясняется случайным характером аминного ПЭГилирования.

Одним из способов избежать проблем неспецифического ПЭГилирования является использование сайт-специфических реакций по определенным остаткам, расположенным вдали от активного или связывающего сайта белка. Химическая модификация природных аминокислот включает алкилирование N—концевой аминогруппы белка путем восстановительного аминирования и может быть осуществлено даже в присутствии остатков лизина благодаря небольшому различию в значениях pKa между этими двумя типами аминогрупп. Однако небольшое количество модификаций лизинов обычно все же происходит. С помощью этого подхода было достигнуто N—концевое моно-ПЭГилирование GH [7]. Полученные конъюгаты показали увеличение периода полувыведения в 4,5 раза по отношению к hGH.

В другом исследовании был синтезирован N—концевой ПЭГилированный hGH с использованием двух различных линкеров: фенил-амидного и этильного. ПЭГ, полученный с использованием фенил-амидного линкера, оказался лучше, чем в случае пропильного, с точки зрения протеолитической чувствительности, иммуногенности, фармакокинетических параметров и фармакодинамики. Введение крысам ПЭГ-фенила значительно увеличивало концентрацию ИФР-1 по сравнению с ПЭГ, причем пик циркулирующих уровней приходился на 24 ч [8].

Распространенным методом сайт-специфического ПЭГилирования белков является присоединение цепи ПЭГ через тиоловую группу цистеина, введенного методами генной инженерии. В этом случае неспаренный остаток цистеина генетически кодируется в белке. Модификация осуществляется путем реакции свободного цистеина с малеимидной группой, присоединенной к молекуле ПЭГ. Аминокислотная замена с установкой цистеина в определенном месте хорошо работает в качестве метода подготовки для сайт-специфического ПЭГилирования. Однако при этом нет гарантии, что модифицированный белок будет формировать правильную третичную структуру и не образует нежелательный дисульфидный димер. В качестве альтернативы нативные дисульфидные связи могут быть восстановлены с образованием доступных для реакции цистеинов [9].

Во многих исследованиях изучалось влияние места конъюгации на биоактивность GH. Например, в патенте Bolder Biotechnology Inc. оценивались три варианта GH, специфичные по сайту ПЭГилирования (hGH-T3C-PEG, hGH-S144CPEG и hGH-T148C-PEG), и было показано, что ПЭГилированные молекулы обладают значительно более высокой биоактивностью по сравнению с неспецифическим амин-ПЭГилированным hGH [10]. В другом исследовании этой группы показано, что присоединение ПЭГ 20 кДа к аминокислотному сайту T3Cувеличивает биоактивность in vitro в 100 раз по сравнению с амин-ПЭГилированным GH с пятью–шестью ПЭГ 5 кДа [11]. Период полувыведения конъюгата PEG-T3C-GH с массой 20 кДа был увеличен до 9 ч. Авторами показано, что PEG-T3C-GH стимулирует дозозависимое увеличение массы тела и ширины большой берцовой кости у крыс.

В последние годы, благодаря достижениям в области расширения генетического кода, стало возможным присоединение полимеров в альтернативных местах, в частности, на неканонические аминокислоты, содержащие инициатор полимеризации. Широко используется введение неприродных аминокислот, содержащих азидные или алкиновые функциональные группы, которые совместимы с катализируемым медью «клик»-циклоприсоединением [12]. Включение в состав hGH аминокислоты — п-ацетилфенилаланина (pAcF) — позволило осуществить сайт-специфическую конъюгацию с ПЭГ-оксиамином с выходом 80–97%. Однако экспрессия pAcF-модифицированного hGH в E. coli варьировал от 20% до 70% от уровня GH дикого типа. Шесть вариантов pAcF-hGH (Y35, F92, Q131, R134, Y143 и K145) из 20 обладали сходной биоактивностью in vitro, а их конъюгаты демонстрировали более длительный период полувыведения, чем нативный hGH. ПЭГилированный Y35pAcF-hGH по сравнению с другими вариантами демонстрировал более высокую фармакодинамическую активность и вызывал увеличение массы тела у гипофизэктомированных крыс, что подчеркивает важность расположения сайтов ПЭГилирования [13].

Также созданы варианты hGH, содержащие неприродную аминокислоту Nε-2-азидэтилоксикарбонил-l-лизин в выбранных позициях (Y35, G131 и K145). Период полувыведения конъюгатов с ПЭГ hGH 20 кДа (Y35, G131 и K145) составил 11,3, 6,4 и 8,0 ч соответственно, а с ПЭГ 40 кДа — 29,0, 7,6 и 8,6 ч соответственно. Сайт-специфическое ПЭГилирование более чем по одному из сайтов снижает иммуногенность и улучшает фармакокинетический профиль при сохранении биоактивности по сравнению с ПЭГилированием по одному сайту [14]. Примечательно, что включение неприродной аминокислоты неизбежно приводило к снижению выхода экспрессии белка и в некоторых случаях сопровождалось образованием усеченного побочного продукта.

Еще одним методом конъюгации полимеров с белками является ферментативная модификация аминокислот природного происхождения. В этом случае используется фермент, который, как правило, распознает определенную аминокислотную последовательность. Например, ферментативное сайт-специфическое ПЭГилирование hGH проводят микробной трансглутаминазой (mTGase, ТГазы). hGH содержит 13 остатков глутамина, но только Gln141 и Gln40 могут быть модифицированы мТГазой. Проблемами являются контроль того, какой именно остаток глутамина вступит в реакцию, и получение высокого выхода однородного моно-ПЭГилированного белка. В ряде работ предпринимались попытки решить эту проблему путем отбора высокоселективных ферментов или повышения селективности мТГазы в ходе реакции. Авторы работы [15]провели скрининг мТГаз, обладающих более высокой специфической активностью в отношении Gln141 hGH. Другие исследователи разработали метод прямой идентификации остатка Gln, конъюгированного с монодисперсным Boc-PEG-NH₂ с помощью масс-спектрометрии [16]. Этот метод опробован на hGH.

В дальнейшем был исследован подход к повышению специфичности мТГазы, позволяющий получать монозамещенный продукт для некоторых белков, содержащих более одного Gln в качестве субстратов мТГазы, таких как hGH. Ферментативное ПЭГилирование дает единичные моно-ПЭГилированные конъюгаты в присутствии сорастворителей в реакционной смеси, что, вероятно, является результатом влияния на вторичную структуру белка и активность мТГазы. Например, в присутствии 50 об.% этанола конъюгация с низкомолекулярным или высокомолекулярным PEGNH₂ приводила к образованию моно-ПЭГилированного по Gln141 hGH [17]. В работе [18] hGH был сайт-специфически ПЭГилирован на Gln40 с помощью мТГазы при оптимизированном соотношении ПЭГ к белку, значении рН и времени реакции. Авторы обнаружили, что сорастворитель улучшает селективность мТГазы, вторичная структура hGH не изменялась в присутствии этанола или метанола, но его третичная структура была нарушена.

Способ введения цепи ПЭГ вокруг белка, а также место конъюгации имеют принципиальное значение, поскольку ПЭГ может стерически нарушать процесс распознавания белка рецептором. N—концевое химическое ПЭГилирование (PEG-N_ter-GH) и ферментативное мечение hGH по Gln141 с помощью ТГазы (PEG-Gln141GH) улучшают фармакокинетику этих моноПЭГилированных белков по сравнению с GH, причем существенной разницы в фармакокинетических параметрах междуними не обнаружено [7]. Однократное введение крысам ПЭГ-Gln141-GH или ПЭГ-N_te-GH давало лучший или сопоставимый эффект по сравнению с суточными дозами GH в течение 7 дней по приросту массы тела, длине бедренной кости и ширине диафиза большеберцовой кости. При присоединении ПЭГ 20 кДа существенных различий между двумя сайтами присоединения не наблюдалось [19].

Таким образом, ПЭГилирование является распространенным подходом, используемым для улучшения фармакокинетического профиля и снижения иммуногенности терапевтических белков. С развитием новых методов появилось больше возможностей. Например, использование деградирующих полимеров позволяет избежать таких распространенных проблем, как образование анти-ПЭГ антител и их потенциальное накопление в тканях [20, 21]. Также растет интерес возможностям использования саморазрушающихся «умных» полимеров для модификации фармакологической активности терапевтических белков [22]. Например, полимер может быть сконструирован таким образом, чтобы обеспечить запрограммированное дискретное выделение GH в течение определенного периода времени, имитируя естественный паттерн секреции гипофизарного GH. Однако производство новых полимерных материалов для использования человеком может быть сложным и дорогостоящим.

Слияние белков и присоединение антител для получения гормона роста пролонгированного действия

Слияние белков — еще один подход к увеличению периода полувыведения биотерапевтических препаратов. Например, присоединение HSA (сывороточный альбумин человека) к N—концу гормона роста привело к созданию альбутропина (Albutropin, Teva Pharmaceutical Industries), обладающего улучшенными фармакокинетическими свойствами [23]. По сравнению с нативным гормоном альбутропин демонстрирует 4- и 6-кратное увеличение периода полувыведения в сыворотке крови у крыс и обезьян, соответственно. Кроме того, однократное введение альбутропина по биоактивности сопоставимо с семью последовательными ежедневными инъекциями гормонального гормона. Однако компания Teva прекратила испытания фазы 3 в США и дальнейшую разработку альбутропина по неуказанным причинам.

Альбумин также был связан с hGH путем N—концевой модификации с ПЭГ-гексадеканом (ПЭГ 3,5 или 10 кДа) в качестве линкера [24]. hGH-ПЭГ3,5, соединенный с альбумином, показал более длительный период полувыведения (19,2±1,0 ч), чем hGH (1,9±0,1 ч) и hGHPEG3,5-гексадекан (13,7±0,3 ч [25]). В другом исследовании описана серия конъюгатов hGH-альбумин, полученных с использованием различных линкеров и сайтов, и установлено, что присоединение наиболее легко достигается путем алкилирования или восстановительного алкилирования вводимых остатков цистеина с использованием функционализированных альбумин-связывающих боковых цепей [26]. Позиция L101C на hGH оказалась оптимальной, при этом наблюдалось улучшение фармакодинамических свойств при однонедельном режиме дозирования на крысах.

Слияние с антителами — еще один подход к улучшению фармакокинетических свойств. Например, hGHбыл соединен с гибридным Fc-фрагментом, содержащим частичные Fc-домены иммуноглобулина D (IgD) и IgG4 человека без какого-либо сайт-направленного мутагенеза. Этот белок hGH-F, разработанный компаниями Genexine и Handok, получил название GX—H9. Слияние с Fc-доменом увеличило гидродинамический диаметр с 4,8±0,9 до 10,5±2,1 нм и повысило молекулярную массу до 130 кДа [27]. В исследовании II фазы сообщалось, что GX-H9 перспективен для приема два раза в месяц [28].

В результате многолетних исследований, применение различных стратегий создания препаратов прологнированного действия уже привело к появлению одобренных к клиническому применению препаратов. Declage, представляющий собой GH, упакованный в микросферы гиалуроната натрия, используется в Южной Корее и разрешен в ЕС. Препараты сомапацитан, полученный слиянием с альбумином, и соматрогон — пептидный конъюгат — в 2023 году одобрили в США. Среди лекарств, полученных ПЭГилированием гормона роста, выделяется ободренный в США и странах ЕС лонапегсоматропин, который обеспечивает доставку гормона роста в естественном виде.

Заключение

Рецептор гормона роста является важной мишенью для медикаментозной терапии, которая показана при дефиците гормона роста и других заболеваниях. Короткий период полувыведения немодифицированного соматропина в сыворотке крови является препятствием для удобного применения. Поэтому для модификации активного белка с переменным успехом использовались различные стратегии, приведшие к появлению как веществ, не достигших завершения клинических испытаний, так и уже одобренных препаратов.

Одно из главных преимуществ производных GH длительного действия заключается в том, что они позволяют снизить нагрузку от частых инъекций, поскольку традиционный гормон роста требует ежедневного введения. Конечной целью применения этих препаратов является дальнейшее снижение частоты дозирования до одного раза в 1–2 недели или даже до ежемесячного. Продолжающиеся исследования и достижения в области систем доставки лекарственных средств и технологий разработки рецептур могут привести к разработке новых подходов и улучшению фармакокинетических свойств препаратов.

Важно отметить, что разработка GH длительного действия — сложная и трудная задача, которая требует междисциплинарного подхода с привлечением специалистов в области дизайна лекарственных средств, белковых/пептидных и полимерных технологий, фармакокинетики и фармакодинамики, а также разработчиков рецептур. Однако необходимость и перспективность этого очевидна как для исследователей, так и пациентов.

1.         Clayton, P.E., Cowell, C.T., Safety issues in children and adolescents during growth hormone therapy—a review. Growth Hormone & IGF Research, 2000. 10(6): p. 306-317. DOI: https://doi.org/10.1054/ghir.2000.0175.

2.         Kopchick, J.J., History and future of growth hormone research. Hormone research, 2003. 60(Suppl. 3): p. 103-112.

3.         Wang, Y., Kim, M., Buckley, C., Maynard, H.D., Langley, R.J., Perry, J.K., Growth hormone receptor agonists and antagonists: From protein expression and purification to long‐acting formulations. Protein Science, 2023. 32(9): p. e4727.

4.         Junnila, R.K., Kopchick, J.J., Significance of the disulphide bonds of human growth hormone. Endokrynologia Polska, 2013. 64(4): p. 300-305.

5.         Lippe, B., Frasier, S.D., Kaplan, S.A., Use of growth hormone-gel. Archives of Disease in Childhood, 1979. 54(8): p. 609. DOI: 10.1136/adc.54.8.609.

6.         Clark, R., Olson, K., Fuh, G., Marian, M., Mortensen, D., Teshima, G., Chang, S., Chu, H., Mukku, V., Canova-Davis, E., Long-acting growth hormones produced by conjugation with polyethylene glycol. Journal of Biological Chemistry, 1996. 271(36): p. 21969-21977.

7.         da Silva Freitas, D.b., Mero, A., Pasut, G., Chemical and enzymatic site specific PEGylation of hGH.Bioconjugate chemistry, 2013. 24(3): p. 456-463.

8.         Wu, L., Ji, S., Shen, L., Hu, T., Phenyl amide linker improves the pharmacokinetics and pharmacodynamics of N-terminally mono-PEGylated human growth hormone. Molecular Pharmaceutics, 2014. 11(9): p. 3080-3089.

9.         Ko, J.H., Maynard, H.D., A guide to maximizing the therapeutic potential of protein–polymer conjugates by rational design. Chemical Society Reviews, 2018. 47(24): p. 8998-9014.

10.       US 6753165 B1, 2004.

11.       Cox, G.N., Rosendahl, M.S., Chlipala, E.A., Smith, D.J., Carlson, S.J., Doherty, D.H., A long-acting, mono-PEGylated human growth hormone analog is a potent stimulator of weight gain and bone growth in hypophysectomized rats. Endocrinology, 2007. 148(4): p. 1590-1597.

12.       Lee, T.C., Kang, M., Kim, C.H., Schultz, P.G., Chapman, E., Deniz, A.A., Dual unnatural amino acid incorporation and click‐chemistry labeling to enable single‐molecule FRET studies of p97 folding.ChemBioChem, 2016. 17(11): p. 981-984.

13.       Cho, H., Daniel, T., Buechler, Y.J., Litzinger, D.C., Maio, Z., Putnam, A.-M.H., Kraynov, V.S., Sim, B.-C., Bussell, S., Javahishvili, T., Optimized clinical performance of growth hormone with an expanded genetic code.Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011. 108(22): p. 9060-9065.

14.       Wu, L., Chen, J., Wu, Y., Zhang, B., Cai, X., Zhang, Z., Wang, Y., Si, L., Xu, H., Zheng, Y., Precise and combinatorial PEGylation generates a low-immunogenic and stable form of human growth hormone. Journal of Controlled Release, 2017. 249: p. 84-93.

15.       Zhao, X., Shaw, A.C., Wang, J., Chang, C.-C., Deng, J., Su, J., A novel high-throughput screening method for microbial transglutaminases with high specificity toward Gln141 of human growth hormone. Journal of Biomolecular screening, 2010. 15(2): p. 206-212.

16.       Mero, A., Spolaore, B., Veronese, F.M., Fontana, A., Transglutaminase-mediated PEGylation of proteins: direct identification of the sites of protein modification by mass spectrometry using a novel monodisperse PEG.Bioconjugate Chemistry, 2009. 20(2): p. 384-389.

17.       Mero, A., Schiavon, M., Veronese, F.M., Pasut, G., A new method to increase selectivity of transglutaminase mediated PEGylation of salmon calcitonin and human growth hormone. Journal of controlled release, 2011. 154(1): p. 27-34.

18.       Khameneh, B., Jaafari, M.R., Hassanzadeh-Khayyat, M., Varasteh, A., Chamani, J., Iranshahi, M., Mohammadpanah, H., Abnous, K., Saberi, M.R., Preparation, characterization and molecular modeling of PEGylated human growth hormone with agonist activity. International journal of biological macromolecules, 2015. 80: p. 400-409.

19.       Grigoletto, A., Mero, A., Zanusso, I., Schiavon, O., Pasut, G., Chemical and Enzymatic Site Specific PEGylation of hGH: The Stability and in vivo Activity of PEG‐N‐Terminal‐hGH and PEG‐Gln141‐hGH Conjugates. Macromolecular Bioscience, 2016. 16(1): p. 50-56.

20.       Thi, T.T.H., Pilkington, E.H., Nguyen, D.H., Lee, J.S., Park, K.D., Truong, N.P., The importance of Poly (ethylene glycol) alternatives for overcoming PEG immunogenicity in drug delivery and bioconjugation. Polymers (Basel) 12 (2): 298. 2020.

21.       Ibrahim, M., Ramadan, E., Elsadek, N.E., Emam, S.E., Shimizu, T., Ando, H., Ishima, Y., Elgarhy, O.H., Sarhan, H.A., Hussein, A.K., Polyethylene glycol (PEG): The nature, immunogenicity, and role in the hypersensitivity of PEGylated products. Journal of Controlled Release, 2022. 351: p. 215-230.

22.       Fogueri, L.R., Singh, S., Smart polymers for controlled delivery of proteins and peptides: a review of patents.Recent patents on drug delivery & formulation, 2009. 3(1): p. 40-48.

23.       Osborn, B.L., Sekut, L., Corcoran, M., Poortman, C., Sturm, B., Chen, G., Mather, D., Lin, H.L., Parry, T.J., Albutropin: a growth hormone–albumin fusion with improved pharmacokinetics and pharmacodynamics in rats and monkeys. European journal of pharmacology, 2002. 456(1-3): p. 149-158.

24.       Wu, L., Ji, S., Hu, T., N-Terminal Modification with Pseudo-Bifunctional PEG-Hexadecane Markedly Improves the Pharmacological Profile of Human Growth Hormone. Molecular Pharmaceutics, 2015. 12(5): p. 1402-1411.

25.       Wu, L., Ho, S.V., Wang, W., Gao, J., Zhang, G., Su, Z., Hu, T., N-terminal mono-PEGylation of growth hormone antagonist: Correlation of PEG size and pharmacodynamic behavior. International journal of pharmaceutics, 2013. 453(2): p. 533-540.

26.       Ramírez-Andersen, H.S., Behrens, C., Buchardt, J., Fels, J.J., Folkesson, C.G., Jianhe, C., Nørskov-Lauritsen, L., Nielsen, P.F., Reslow, M., Rischel, C., Long-acting human growth hormone analogue by noncovalent albumin binding. Bioconjugate Chemistry, 2018. 29(9): p. 3129-3143.

27.       Kim, E.-S., Yang, S.Y., Lee, M.N., Jin, K.S., Cha, H.J., Kim, J.K., Sung, Y.C., Choi, K.Y., Controlled release of human growth hormone fused with a human hybrid Fc fragment through a nanoporous polymer membrane.Nanoscale, 2013. 5(10): p. 4262-4269.

28.       Ku, C.R., Brue, T., Schilbach, K., Ignatenko, S., Magony, S., Chung, Y.-S., Kim, B.-J., Hur, K.Y., Kang, H.-C., Kim, J.H., Long-acting FC-fusion rhGH (GX-H9) shows potential for up to twice-monthly administration in GH-deficient adults. European Journal of Endocrinology, 2018. 179(3): p. 169-179.