Более 100 лет назад Эмиль Фишер и Франц Хофмайстер одновременно обнаружили, что аминокислоты в пептидах и белках связаны амидной связью. Как и во многих других областях исследований, область химии пептидов быстро развивалась в течение последних десятилетий. Самый первый дипептид синтетических путем был получен в 1901 году, а первый же пептид биологической важности, трипептид глутатион, был синтезирован в 1935 году. Непрерывное развитие новых синтетических методов позволило получить все более крупные пептиды, кульминацией которых стали основные этапы синтеза окситоцина (1953 г.), инсулина (1963–1966 гг.) и несколько небольших белков – например, рибонуклеазы (1969, 1981 гг.) и протеазы ВИЧ-1 (1988 г.) [1]. Основной движущей силой этих работ была необходимость получения пептидных гормонов и нейропептидов для терапевтических целей. На сегодняшний день были синтезированы многочисленные аналоги таких пептидов для изучения их молекулярного взаимодействия с соответствующими рецепторами, для изменения их биологической активности и для повышения их стабильности в организме. С помощью компьютерного дизайна, скрининга фаговых систем и библиотек пептидов ведется непрерывная разработка потенциально терапевтических пептидов.
Однако пептиды имеют репутацию соединений с ограниченной стабильностью. В отличие от небольших органических молекул, пептиды и белки обладают не только первичной структурой (последовательностью аминокислот), но также, в случае белков, структурами более высокого порядка (вторичной, третичной и четвертичной), которые необходимы для проявления биологической активности. Нестабильность малых синтетических пептидов включает в себя главным образом химические пути деградации. В случае белков, пути деградации также включают химические превращения, которые аналогичны тем, которые наблюдаются в пептидах, а также физическую нестабильность. Химическая нестабильность может быть определена как любой процесс, включающий модификацию белка или пептида путем образования связи (например, окисления) или расщепления связи (например, дезамидирования), приводящего к появлению нового химического соединения. (Таблица 1) [2]. Кроме того, стоит упомянуть ферментативную деградацию, которая может привести к полному разрушению пептида с образованием коротких фрагментов (например, трипсинолиз). Такой путь разрушения может реализовываться как под действием ферментов внутри организма, так и из-за контаминации препарата микроорганизмами. Напротив, физическая нестабильность не включает модификации белка с затрагиванием ковалентных связей. К ней обычно относят изменения в структуре более высокого порядка (вторичной и выше). Физическая нестабильность вызывает денатурацию, которая может привести к адсорбции вещества на поверхностях, агрегации и выпадению осадков (Таблица 1) [2].
Таблица 1. Разрушение пептидов и белков
Физическая нестабильность | Химическая нестабильность | Ферментативная нестабильность |
Денатурация | Гидролиз | Гидролиз |
Адсорбция | Окисление | Дезамидирование |
Агрегация | Рацемизация | Декарбоксилирование |
Осаждение | Изомеризация | Окисление |
β-Элиминирование | Aцилирование и др. | |
Дисульфидный обмен |
В этом заключается основное отличие пептидов и белков от большинства других химических соединений. Их химическая, физическая и ферментативная нестабильность представляют собой проблему при разработке и производстве пептидных и белковых лекарств.
В большинстве случаев чистые пептиды получают в виде аморфных твердых веществ, предпочтительно путем лиофилизации (лиофильной сушки). Как правило, пептиды и белки имеют тенденцию удерживать различные количества воды и кислот (в виде противоионов или остаточной кислоты) после конечной стадии очистки или выделения. Кроме того, пептиды зачастую хранятся в виде их соответствующих ацетатов, трифторацетатов или гидрохлоридов. Разработаны специальные алгоритмы оценки стабильности твердых пептидных препаратов путем тестирования их свойств при хранении при различных температурах в течение разных периодов времени [3]. Разложение или порча могут происходить в результате окисления, поглощения или выделения влаги, воздействия тепла или света, или взаимодействия с поверхностями.
Сухие пептиды обычно более стабильны по сравнению с соответствующими водными растворами. В последнем случае природа растворителя, концентрация, pH и температура оказывают большое влияние на стабильность. Адсорбция на поверхности контейнера, инактивация, рацемизация, окисление, дезамидирование, расщепление цепи, образование дикетопиперазина и перегруппировки являются наиболее известными проявлениями нестабильности пептидов в растворе. Однако известны редкие случаи, когда стабильность белка в твердом состоянии меньше или сопоставима с наблюдаемой в растворе [4]. В твердом состоянии химическая нестабильность проявляется так же, как и в растворе (расщепление связи, образование связи, перегруппировка или замещение), но зачастую в меньшей мере. Типичными реакциями являются дезамидирование Asn и Gln, окисление по атомам серы Cys и Met, также окисляется Trp, дисульфидный обмен по Cys, расщепление пептидной связи, элиминирование и димеризация/агрегация [4]. Пептиды и белки в пищевых продуктах, а также в фармацевтических составах могут вступать в реакцию с непротеиновыми соединениями. Потеря Lys в пищевых белках в основном связана с реакцией Майяра (реакция сахароаминной конденсации), но другие аминокислотные остатки, такие как Arg, Asn и Gln, также способны реагировать с восстанавливающими сахарами. На первой стадии реакция конденсации между карбонильной группой восстанавливающего сахара и аминогруппой образует N-замещенный гликозиламин; за этим следует преобразование в основание Шиффа. Это также может быть проблемой в лекарственных препаратах. Последующая циклизация и перегруппировка Амадори (изомеризация N-гликозидов альдоз в 1-амино-1-дезоксикетозы) дает типичные производные, которые вызывают изменение цвета препарата [4], также как и окисления Trp вызывает изменение цвета. Соответственно, чем больше в составе пептида вышеперечисленных реакционноспособных аминокислотных фрагментов, тем менее стабильна молекула в целом.
Причины, по которым эти и другие реакции химической деградации могут происходить в «сухих» составах, неясны. Влажность, температура и наполнители композиции (например, полимеры) являются основными факторами, влияющими на химическую нестабильность пептидов и белков в твердом состоянии. Предполагается, что активность протонов в твердом состоянии может оказывать такое же влияние на стабильность, как и рН в растворе. Подробная информация о стабильности белков и пептидов в твердом состоянии рассмотрена в обзоре [5].
Известны общие факторы, которые влияют на стабильность пептидных и белковых спиралей. Взаимодействие боковой цепи, которое стабилизирует пептидную спираль, будет способствовать стабильности белка. Например, S-пептидная спираль S-РНКазы может быть стабилизирована в различной степени посредством дипольного взаимодействия заряд-спираль путем изменения заряда на N-концевом остатке. Когда производные S-пептида, содержащие различные заряды на N-концевом остатке, включены в S-РНКазу, термостабильность белка изменяется так же, как и стабильность изолированной спирали S-пептида. Во-вторых, ожидается, что склонность спирали к воздействию остатка растворителя в спирали белка повлияет на стабильность белка так же, как он влияет на изолированную спираль [1]. Также было продемонстрировано, что дисульфидные мостики в белке существенно повышают устойчивость к денатурации под воздействием тепла, солей или других разрушающих факторов. Таким образом, образованию дисульфидов можно рассматривать в качестве удобного метода стабилизации вторичной структуры [1].
Существует стратегия стабилизации пептидов на стадии их дизайна, которая заключается в поиске экспериментальными средствами любых признаков стабильной конформации и в повышении ее стабильности путем включения стерических и/или ковалентных ограничений. Эти ограничения стабилизируют конкретную конформацию молекулы и могут коррелировать с повышенной способностью к связыванию с рецептором. Это особенно верно, если предпочтительный конформер сохраняется в разных средах [1]. В некоторых случаях введение D-аминокислоты может увеличить биологическую активность. Кроме того, замены на D-аминокислоту могут значительно повысить устойчивость пептидов к биодеградации [1]. Результаты, полученные в процессе биологических исследований с участием циклопептидов, указывают на то, что этот класс соединений часто характеризуется повышенной метаболической стабильностью, повышенной селективностью к рецепторам, контролируемой биодоступностью и улучшенными профилями активности. Циклопептиды могут метаболизироваться в организмах млекопитающих только в очень ограниченной степени из-за их устойчивости к ферментативной деградации; однако они легче выводятся через печеночный клиренс, чем аналоги с открытой цепью из-за их повышенной липофильности [4].
Хотя верно, что в водных средах может происходить гидролиз, опыт показывает, что правильный выбор добавок и стабилизаторов отчасти помогает преодолеть это препятствие. Стабильность пептида в растворе зависит от типа растворителя, рН (рН 5-7 считается оптимальным) и аминокислотной последовательности. Пептиды, содержащие Asn, Gln, Cys, Met, Trp или Tyr, обычно менее стабильны. Очевидная нестабильность (исчезновение пептида из препарата) часто является артефактом. Например, ацилированные липопептиды с длинной цепью имеют тенденцию к самоассоциации и образованию гелей, которые вызывают затруднения при анализе [6].
Обнаружение присутствия пептида в составе через 6–12 месяцев после изготовления продукта может быть затруднено, когда пептид присутствует в микромолярных и более низких концентрациях. Специальные аналитические методы, такие как дериватизация, масс-спектрометрия (также в сочетании с ВЭЖХ) и флуоресцентная спектрометрия, должны разрабатываться индивидуально для каждого пептида.
Важным условием является обеспечение и сохранение стерильности и микробиологической чистоты пептидных препаратов, поскольку пептиды являются прекрасной питательной средой для различных микроорганизмов. Так, пептоны – продукты неполного ферментативного гидролиза белков, содержащие смесь олигопептидов, коротких пептидов и аминокислот, применяются как основной компонент питательных среды для культивирования бактерий и одноклеточных грибов. Для пептидов, используемых в качестве лекарственных препаратов, контроль стерильности проводят согласно действующей Государственной фармакопеи [7].
Испытания стабильности пептидов и других препаратов обычно осуществляют методом «ускоренного старения» в специализированных климатических камерах. Исследуемое вещество выдерживают при температуре и влажности, превышающих температуру и влажность его хранения. Повышенная температура ускоряет физико-химические процессы (правило Вант-Гоффа), которые обычно приводят к порче и разрушению препарата. Таким образом, время эксперимента, необходимое для установления срока годности, значительно сокращается по сравнению с аналогичным испытанием при температуре хранения – например, для индивидуального вещества сроку хранения 2 года при 25 °С соответствует сроки экспериментального хранения 30 суток при 60 °С. По результатам такого испытания также можно решить обратную задачу – установить рекомендуемую температуру хранения для заданного промежутка времени. Для пептидных лекарственных препаратов испытания стабильности проводят согласно действующей Государственной фармакопеи [8]. По завершению испытания проводят соответствующие анализы сохранности качества препарата.
Исходя из суммы литературных данных и практического опыта авторов данного обзора, можно вывести ряд общих рекомендаций для конечных пользователей пептидных препаратов, исследователей и разработчиков.
Рекомендации:
Дополнительно:
1. Peptides. Synthesis, Structures, and Applications. 1995, San Diego: Academic Press. p. 518.
2. Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. The Taylor & Francis Series in Pharmaceutical Sciences. 1999, London: The Taylor & Francis. p. 257.
3. Stability and characterization of protein and peptide drugs: case histories. Pharmaceutical Biotechnology, ed. R.T. Borchardt. Vol. 5. 2013, New York: Springer Science & Business Media. p. 371.
4. Sewald, N., Jakubke, H.-D., Peptides: Chemistry and Biology. 2002, Darmstadt: Wiley-VCH. p. 590.
5. Lai, M.C., Topp, E.M., Solid-state chemical stability of proteins and peptides. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1999. 88(5): p. 489-500. DOI: 10.1021/js980374e.
6. Cosmetic Dermatology Products and Procedures. 2 ed. 2016, New Delhi, India: John Wiley & Sons. p. 563.
7. Микробиологическая чистота. ОФС.1.2.4.0002.18 (Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I)
8. Стабильность и сроки годности лекарственных средств. ОФС.1.1.0009.18. (Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I)
9. Kraut, A., Marcellin, M., Adrait, A., Kuhn, L., Louwagie, M., Kieffer-Jaquinod, S., Lebert, D., Masselon, C.D., Dupuis, A., Bruley, C., Jaquinod, M., Garin, J., Gallagher-Gambarelli, M., Peptide Storage: Are You Getting the Best Return on Your Investment? Defining Optimal Storage Conditions for Proteomics Samples. Journal of Proteome Research, 2009. 8(7): p. 3778-3785. DOI: 10.1021/pr900095u.
10. Burke, C.J., Steadman, B.L., Volkin, D.B., Tsai, P.-K., Bruner, M.W., Middaugh, C.R., The adsorption of proteins to pharmaceutical container surfaces. International Journal of Pharmaceutics, 1992. 86(1): p. 89-93. DOI: 10.1016/0378-5173(92)90034-Y.
11. Stejskal, K., Potěšil, D., Zdráhal, Z., Suppression of Peptide Sample Losses in Autosampler Vials. Journal of Proteome Research, 2013. 12(6): p. 3057-3062. DOI: 10.1021/pr400183v.