Ежегодно более 5 млн. человек в мире подвергаются ядовитым укусам змей, скорпионов, пауков, пчел, медуз. Некоторые животные имеют природную защиту от действия ядов. Из сыворотки опоссума был выделен эффективный антидот – фактор нейтрализации смертельного токсина (LTNF), на основе которого были разработаны пептиды LT-15, LTNF11-CS и LT-10

Ядовитые укусы змей

Укус змеи – это особая форма травмы, которая встречается во всем мире, и чаще всего – в сельской местности. В зависимости от вида змей, введенный яд вызывает широкий спектр токсических эффектов, начиная от местного повреждения тканей и заканчивая системной недостаточностью органов. Змеиные яды многофункциональны, и применяются животными для обороны, охоты, а также для (частичного) переваривания пищи. Химически, они представляют собой сложную смесь ферментов (гидролаз), токсических полипептидов, белков (антикомплементарные факторы, фактор роста нервов) и др. Ряд ферментов обнаруживается у практически всех змей (гиалуронидаза, фосфодиэстераза, фосфолипаза А2, оксидаза L-аминокислот) [1]. В яде морских змей и аспидов содержатся нейротоксины – полипептиды, вызывающие паралич путем нарушения в нервно-мышечных синапсах передачи импульсов, что ведет к гибели из-за остановки дыхания. Одним из активных компонентов таких ядов является ацетилхолинэстераза, дезактивирующая ацетилхолин и способствующая наступлению паралича. Ацетилхолинэстераза не выделяется с ядом у гадюк и ямкоголовых змей, однако они вырабатывают широкий спектр протеолитических ферментов, вызывающих повышение сосудистой проницаемости, нарушения свертываемости крови и геморрагические отеки.

Укус змеи вызывает множество клинических последствий. Местные симптомы и признаки включают боль в месте укуса, отек и болезненную регионарную лимфаденопатию. Неспецифические системные симптомы включают тошноту, рвоту, головную боль, потоотделение, боль в животе и диарею [2]. Системное отравление может вызывать основные токсические синдромы, включая нейротоксичность, миотоксичность и коагулопатию. Различные виды змей связаны с характерными паттернами синдромов. Эти различия обусловлены изменчивым составом неферментативных и ферментативных токсинов, включая цитотоксины, миотоксины, нейротоксины и гемотоксины. Гемотоксины связаны с сердечно-сосудистыми и гемостатическими эффектами, включая гипотензию, сердечно-сосудистый коллапс, коагулопатию и кровотечение.

Хотя противоядия эффективно предотвращают или ограничивают системные эффекты, лечение местных симптомов остается проблематичным, особенно в случаях некроза мягких тканей и синдрома компартмента. Местные признаки отравления включают сильную боль и неподвижность конечности, сильно опухшей, холодной и без явного пульса. Клинически этот набор цитотоксических симптомов может быть неотличим от одновременно развивающегося компартмент-синдрома [3].

Ежегодно ядовитые змеи кусают около пяти миллионов человек. Около половины из них имеют признаки отравления, и около 100–125 тыс. умирают [4]. В реальности, эти цифры еще выше, поскольку многие случаи укусов происходят в неразвитых странах и трудно поддаются учету. Хотя укус змеи не представляет такой большой проблемы для здоровья, как болезни сердца или даже смертность в ДТП, он действительно причиняет значительные страдания, по крайней мере, в некоторых географических районах и среди определенных групп населения. Например, отравления ямовой гадюкой в Соединенных Штатах ежегодно ведут к около 2700 госпитализаций, также фиксируется более 100 тыс. укусов кошек и собак [5].

В настоящее время использование противоядий является единственным доступным средством лечения отравлений, вызванных ядовитыми животными, а именно змеями, также скорпионами, пауками, клещами и медузами. Противоядия обычно вырабатываются крупными животными, в основном лошадьми, однако большой процент населения страдает аллергией на белки лошади. У 20% пациентов в клинических испытаниях также наблюдалась негативная реакция на противоядия, выделенного из овец [6].

Известно, что некоторые теплокровные животные обладают устойчивостью к укусам змей; антигеморрагические и антилетальные компоненты были выделены из сывороток опоссума, мангуста, суриката и ежа, а также ядовитых и неядовитых змей.

Исследование пептидных противоядий

Антилетальный фактор, названный фактором нейтрализации смертельного токсина (Lethal Toxin Neutralizing Factor, LTNF) был выделен в чистом виде из сыворотки опоссума (Didelphis virginiana) в 1999 году с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) [6]. Молекулярная масса LTNF составляет 63 кДа, и он не вызывает соосаждения путем иммунодиффузии с ядами или токсинами.

Было показано, что смерть из-за внутрибрюшинной инъекции мышам заранее определенной смертельной дозы яда от основных семейств змей, например, гремучие змеи (Crotalidae), аспиды (Elapidae), гадюки (Viperidae) и морские змеи (Hydrophiidae), предотвращается с помощью последующего внутрибрюшинного введения LTNF. Кроме того, LTNF нейтрализует смертельный исход от ядов скорпионов и пчел, а также токсинов от различных животных, растений и бактерий. Таким образом, естественный LTNF из сыворотки опоссума показал потенциал в качестве универсальной терапии отравлений, вызванных ядами животных, растений и бактерий [6]. Эти результаты подтолкнули к дальнейшему изучению сыворотки опоссума и поиску ее наиболее активных компонентов.

Годом позже, в 2000 году, выделенный из сыворотки опоссума и очищенный LTNF ферментативно расщепили с помощью трипсина, чтобы вызвать фрагментацию по сайтам аргинина и лизина [7]. Фрагменты разделили с помощью ВЭЖХ и тестировали против анти-LTNF на сродство к связыванию с помощью иммуноферментного теста (ELISA). Фрагмент, демонстрирующий наибольшее связывание с анти-LTNF, секвенировали. В результате были выявлены наиболее активные фракции, и на основе доминирующих последовательностей фрагментов были сконструированы и синтезированы пептиды, состоящие из 15 и 10 аминокислот с N-конца, обозначенные как LT-15 (LTNF15), с аминокислотной последовательностью Leu-Lys-Ala-Met-Asp-Pro-Thr-Pro-Pro-Leu-Trp-Ile-Lys-Thr-Glu (LKAMDPTPPLWIKTE), молекулярная масса 1740,18 Да, и LT-10 (LTNF10) с последовательностью Leu-Lys-Ala-Met-Asp-Pro-Thr-Pro-Pro-Leu (LKAMDPTPPL), масса 1082,39 Да. Как видно из формул, LT-15 от LT-10 отличается лишь добавлением пяти аминокислотных остатков на C-конце пептида.

В экспериментах, мышам вводили яд или токсин в различных концентрациях для достижения летальной дозы. Летальность ядов варьируется от одного вида к другому; яд медоносной пчелы оказался наиболее смертоносным – всего 1 мкг/мышь. Яду C. atrox необходимо 300 мкг, чтобы убить мышь такого же веса [8]. Смертельная доза токсинов также варьировалась от токсина к токсину. Ботулинический токсин оказался наиболее токсичным после рицина, 0,5 и 1,0 мкг/мышь, соответственно.

Мышам (n=6) вводили внутримышечно каждый яд или токсин в объеме ноителя 0,1 мл. Животных разделили на две группы. Контрольным мышам в месте инъекции вводили 0,5 мл солевого буфера (PBS), а мышам другой группы – 500 мкг LT-15 в 0,5 мл. За инъецированными мышами наблюдали в течение недели. Все мыши в контрольной группе погибли, тогда как LT-15 обеспечил выживаемость 100%. В другом эксперименте использовали девять мышей. Мышам внутримышечно вводили заранее установленную смертельную дозу в 0,1 мл. Мышей разделили на три группы, по три в каждой. Мышам в группе II вводили 500 мкг LT-10 за два часа до инъекции яда или токсина. Контрольные мыши в группе I получали PBS через два часа после инъекции яда или токсина. Аналогичным образом, мыши в группе III получали 500 мкг LT-10 через два часа после инъекции яда или токсина. В течение недели все мыши в контрольной группе погибли, в группах, обработанных пептидом, гибель была предотвращена на 100%.

Синтетические LT-10 и LT-15, состоящий из аминокислот естественного LTNF опоссума, оказались эффективной сывороткой в подавлении летальности ядов змеи (C. atrox), скорпиона и медоносных пчел. Также они были эффективны для нейтрализации смертельного действия кобратоксина, рицина растительного происхождения и ботулотоксина. Кроме того, LT-10 подавлял летальность при введении за 2 часа до инъекции яда или токсина. Наиболее важно то, что летальность подавлялась при введении LT-10 даже через 2 часа после инъекции яда или токсина. Смерть из-за внутримышечной инъекции заранее определенных смертельных доз токсинов предотвращалась обработкой мышей синтетическими пептидами LT-15 и LT-10, как до, так и после введения токсина. Синтетические аналоги LTNF могут производиться промышленно и претендуют на то, чтобы стать универсальной терапией против интоксикации, вызываемой животными, растениями и бактериями. Доза для человека может быть рассчитана на основе массы тела. Поскольку 500 мкг пептида требуется для мыши с массой 20 г, то преобразование в дозу для человека 2500х500 мкг = 1,2 г, что составляет всего лишь 1/50 массы белка, применяемого в качестве серотерапии при укусе змей [7].

Отравление ядом змеи – сложный процесс, включающий прямое действие компонентов яда на ткань и высвобождение различных эндогенных медиаторов. Известно, что змеиные яды вызывают различные нарушения обмена веществ. Сообщалось, что последствия отравления включают высвобождение фармакологически активных веществ, таких как миоглобин, цитокины и оксид азота, которые, как полагают, играют важную роль в патологии отравления. Отравление также вызывает повышение уровня глюкозы и лактата [9]. Снижение уровней эндогенно присутствующих белков, включая фактор роста нервов (NGF), миоглобин, аденозиндезаминазу (ADA), гистамин и иммуноглобулин E (IgE) в органах мышей, является следствием сублетальной инъекции ядов N. kaouthia и медоносной пчелы. Потеря уровней NGF, ADA, миоглобина, гистамина и IgE приводит к развитию различных симптомов. Снижение NGF вызывает невропатию и воспаление, миоглобина – вызывает сердечный приступ или сердечную недостаточность. ADA, гистамин и IgE участвуют в развитии тяжелой аллергии. Отравление ядом змеи вызывает повышение концентрации глюкозы, что похоже на состояние при диабете.

На объединенных гомогенатах органов мышей (головного мозга, сердца, почек, печени, легких, мышц, поджелудочной железы, слюнных желез, кожи, селезенки, яичников и семенников) после введения токсина N. kaouthia и обработки пептидом, методом ELISA было показано, что потеря NGF предотвращалась инъекцией яда против кобры и применением LTNF. Это также предотвращал LT-10, вводимый путем инъекции или перорально, хотя и в меньшей степени, чем LTNF. Повышение концентрации LT-10 может дать лучшие результаты, возвращая уровень NGF в нормальное состояние. Снижение уровня ADA также предотвратил LT-10, введенный инъекционно или перорально, в некоторых случаях доводя уровень до почти нормального состояния. Потерю IgE в сердце и легких после отравления ядом кобры предотвращали с помощью LTNF или LT-10.

Таким образом, синтетический LT-10 действует как эффективный заменитель антител против яда кобры. Вызванное ядом или токсином снижение уровней этих эндогенных белков в органах мышей предотвращалось обработкой LT-10 путем инъекции или перорально. LT-10 был сопоставим с антителом против яда кобры по своей эффективности в возврате эндогенных белков к нормальному или близкому к нормальному уровню. Однако эффективность против яда кобры ограничивается патологией, вызванной ядом [9].

Было замечено, что образцы слюны пациентов с диабетом типа 2 (инсулиннезависимым) и различными аутоиммунными заболеваниями содержали повышенные уровни иммуноглобулина E, фактора роста нервов, миоглобина и инсулина по сравнению с образцами слюны от здоровых людей. В работе [10] предложили продолжительное лечение LT-10 для поддержания нормального уровня IgE. Тучные клетки сохраняются в течение длительного периода времени и секретируют IgE в условиях окружающей среды, эмоционального стресса, физических упражнений и т. д. С другой стороны, лечение моноклональными антителами против IgE не может проводиться постоянно из-за их дороговизны. Применение LT-10 снижает уровень IgE и других белков, что улучшает симптомы у людей, страдающих этими заболеваниями. Нетоксичное лечение LT-10 обеспечило бы хороший способ вернуть уровни IgE к норме, что позволило бы применяемым в настоящее время лекарствам работать более эффективно в отсутствие интерференции IgE [10].

Интересно, что разработчик пептидов LT-10 и LT-15 Бини Липпс (Binie Lipps) не ограничился предложением гипотезы [10], но и поставил эксперимент на самом себе, изучая возможность применения этих соединений в терапии диабета, которым он страдал. Результаты были описаны в патенте [11]. Липпс поставил четыре последовательных эксперимента: №1 – без лечения; №2 – лечение глюкотролом, 10 мг утром и 5 мг вечером; №3 – лечение LT-10 2 мг/день, 1 мг утром и 1 мг вечером; №4 – комбинация LT-10, 2 мг/день и 15 мг/день глюкотрола. Результаты показали, что уровень глюкозы оставался изменчивым во всех четырех экспериментах. В опыте №1 уровень сахара колебался от 116 до 301. В №2 уровень глюкозы колебался от 183 до 214 при лечении глюкотролом, не оказывая заметного влияния на глюкозу. Однако в экспериментах №3 и №4 уровни глюкозы оставались ниже по сравнению с №1 и №2. Колебания в эксперименте №3 составляли от 116 до 183, а в №4 – от 137 до 158. Лечение глюкотролом может снижать уровень глюкозы, как в эксперименте №2. Однако не глюкотрол, но LT-10 снижал уровень глюкозы, как в примерах №3 и №4. Уровни IgE оставались высокими в №1 и №2 без или с применением глюкотрола. Лечение только LT-10 в течение семи дней, как в примере №3, или в комбинации его с глюкотролом, снизило уровни IgE почти до нормального. Результаты ясно показывают, что лечение глюкотролом не способствует снижению уровня IgE. Именно лечение LT-10 вызывает понижение IgE. Уровни NGF оставались высокими в опытах №1 и №2 без или с лечением глюкотролом. Обработка только LT-10 в течение семи дней, так как в №3 снижала уровни NGF почти до нормы. Похоже, что комбинация LT-10 и глюкотрола вызвала повышение уровня NGF, восстанавливая нормальный гомеостаз. Уровни инсулина оставались высокими в экспериментах №1 и №2 без или применением глюкотрола. Обработка только LT-10 в течение семи дней, как в примере №3, или в комбинации с глюкотролом, как в примере №4, снижала уровни инсулина почти до нормального уровня. Уровни миоглобина оставались высокими у пациентов №1 и №2 без лечения или лечения глюкотролом. Обработка только LT-10 в течение семи дней, как в примере №3, снижала уровни миоглобина почти до нормального. Результаты показывают, что, возможно, лечение глюкотролом способствует повышению уровня миоглобина, как показано в опытах № 2 и №4. Этот побочный эффект глюкотрола может быть связан с сердечными заболеваниями. LT-10 рекомендуется изобретателем в качестве лечения связанных с IgE расстройств, таких как астма, депрессия и различные типы аутоиммунных заболеваний – рожистая кожа (СКВ), ревматоидный артрит, синдром Шегрена, синдром Рейтера, сахарный диабет (инсулинозависимый); болезнь Грейвса, болезнь Аддисона, болезнь Ходжкина и др. [11].

Антитела анти-LTNF и анти-LT-10 способны выявлять токсины, включая холерный токсин и дигоксин, которые не могут быть обнаружены в тесте на токсичность на мышах,  в анализе методом ELISA [12]. Кроме того, анти-LTNF и анти-LT-10 не реагировали иммунологически с нетоксичными веществами, фактором роста нервов и коллагеном. В настоящее время биоанализ на мышах является стандартной практикой для обнаружения и анализа токсинов. Аффинность связывания анти-LT-10, измеренная как предел обнаружения методом ELISA, показала линейную взаимосвязь с биоанализом на мышах. Кроме того, анти-LT-10 обнаруживает токсины, которые не смертельны для мышей. Таким образом, анти-LT-10 может оказаться полезным при анализе токсинов в качестве альтернативы биоанализу на животных. Разработка тестирования in vitro с использованием анти-LT-10, который будет использоваться для анализа биологических токсинов в пищевых продуктах, биологических жидкостях и окружающей среде, может быть весьма полезной. В некоторых лабораториях нет помещений для животных или опытного персонала для такой работы. К тому же животные дорогие, и их содержание проблематично. Учитывая всё это, хорошо разработанный, проверенный и стандартизированный тест in vitro имел бы большой исследовательский и коммерческий потенциал [12]. Диагностическое применение антител к пептидам так же защищено патентом [13].

Механизм действия пептидных противоядий находится в стадии исследований. В работе [14] применили методы молекулярного моделирования, стыковки и молекулярно-динамического моделирования для расчета взаимодействия пептида LT-10 с несколькими ферментами змеиного яда, а именно с PLA2 из яда индийской кобры (Naja naja) и атролизином C из яда техасского гремучника (Crotalus atrox). Анализ взаимодействия in silico обеспечил молекулярную основу, которая может объяснить противоядную активность пептида LT-10 по отношению к этим двум токсинам змеиного яда. Подробный анализ выявил Asp5 пептида LT-10 в качестве ключевого остатка, обеспечивающего значительный вклад во взаимодействие с ферментами змеиного яда. Тем самым подавляется ферментативная и биологическая активность, что приводит к потере токсичности. Таким образом, проведенный анализ взаимодействия дал понимание молекулярных деталей, которые могли бы объяснить возможную нейтрализацию токсинов пептидом LT-10. Кроме того, знание ключевых взаимодействий может быть использовано для потенциального использования при открытии лекарств и разработке более эффективных антидотов против токсинов ядовитых змей [14].

Как видно из предыдущих примеров, для проявления активности достаточно десяти аминокислотных остатков, как в пептиде LT-10. Результаты работы [5] подтвердили способность химически синтезированного пептида из одиннадцати аминокислот LTNF11-CS (LKAMDPTPPLW), входящих в пептиды, разработанные Липпсом, нейтрализовать яд техасского гремучника (C. atrox) у мышей, когда летальная доза яда была предварительно инкубирована с пептидом перед последующей внутривенной инъекцией. Кроме того, авторы экспрессировали LTNF-11 в виде конкатенированной цепи из восьми пептидов с С-концевой меткой 6xHis для облегчения последующей очистки пептида. 11-мер был выбран потому, что одиннадцатая аминокислота представляет собой маркерный триптофан и служит сайтом расщепления протеазой для разделения пептидов. Было проведено разделение пептидов на колонке, и конечный продукт был протестирован на мышах; было показано, что он обладает нейтрализующей способностью против яда C. atrox. Анализ продукта методом ЖХ/МС показал частичную очистку пептида. Контрольным мышам (n=8) вводили по 100 мкг яда каждой после предварительной инкубации (30 мин при 37 °C) с физиологическим раствором, в то время как тестовой группе (n=8) вводили по 100 мкг яда каждой после предварительной инкубации (30 мин при 37 °C) с 200 мкг LTNF11-CS. Наконец, другой группе контрольных мышей (n=8) вводили 200 мкг пептида LTNF11-CS, растворенного в физиологическом растворе. Ни одна из восьми мышей не погибла и не показала никаких симптомов отравления. В дополнительном эксперименте тестировали мышей (n=8), получавших только 200 мкг пептида LTNF11-CS путем внутривенной инъекции, и все они остались здоровыми. Этот эксперимент демонстрирует способность пептида нейтрализовать яд без каких-либо вредных эффектов. Кроме того, пептид в своей активной форме может быть легко растворен в физиологическом растворе, а разработанный способ его получения имеет перспективы стать промышленным [5].

Очистка пептидов ставит уникальные задачи в отношении получения желаемого выхода и селективности. Поэтому был разработан процесс получения рекомбинантных LTNF высокой степени очистки. В работе [15] такой процесс был смоделирован для установки, способной производить 10 кг очищенного rLTNF. Пептид получается в форме конкатемера, который был специально разработан для накопления в виде нерастворимых телец включения во время экспрессии в E. coli. Конкатемер rLTNF выделяют на стадии катионообменной хроматографии, а затем полностью расщепляют на мономерный rLTNF с использованием фермента α-химотрипсина. Продукт доводят до чистоты  более 98% обращенно-фазовой ВЭЖХ. Исследование показывает, что рекомбинантная технология может использоваться для рентабельного производства rLTNF [15]. Также известны работы по продуцированию рекомбинантного белка LTNF метилотрофным дрожжевым штаммом Pichia Pastoris [16]. Авторы полагают, что последний способ более эффективный и позволяет получать продукт с минимальным количеством примесей.

Заключение

Животные, устойчивые к действию ядов змей, являются перспективным направлением исследований. Выделенные из них соединения лежат в основе новых пептидных антидотов, безопасных и довольно простых в промышленном производстве. Фактор нейтрализации смертельного токсина (LTNF), выделенный из сыворотки опоссума, как и разработанные на его основе короткие пептиды LT-15, LTNF11-CS и LT-10, могут найти широкое применение для лечения последствий укусов змей или действия других токсинов.

1.         Павлов, О.Б., Грачев, С.С., Ядовитые змеи и первая помощь при укусах змей. Медицинский журнал, 2013(3): p. 15-20.

2.         Noutsos, T., Currie, B.J., Isbister, G.K., Snakebite associated thrombotic microangiopathy: a protocol for the systematic review of clinical features, outcomes, and role of interventions. Systematic Reviews, 2019. 8(1): p. 212. DOI: 10.1186/s13643-019-1133-2.

3.         Kim, Y., Choi, J.-h., Kim, J., Chung, Y., Fasciotomy in compartment syndrome from snakebite. Archives of Plastic Surgery, 2019. 46: p. 69-74. DOI: 10.5999/aps.2018.00577.

4.         Perry, G., Lacy, M., Das, I., Snakes, Snakebites, and Humans, in Problematic Wildlife II: New Conservation and Management Challenges in the Human-Wildlife Interactions, F.M. Angelici, Rossi, L., Editors. 2020, Springer International Publishing: Cham. p. 561-580.

5.         Komives, C.F., Sanchez, E.E., Rathore, A.S., White, B., Balderrama, M., Suntravat, M., Cifelli, A., Joshi, V., Opossum peptide that can neutralize rattlesnake venom is expressed in Escherichia coli. Biotechnology Progress, 2017. 33(1): p. 81-86. DOI: 10.1002/btpr.2386.

6.         Lipps, B.V., Anti-lethal factor from opossum serum is a potent antidote for animal, plant and bacterial toxins. Journal of Venomous Animals and Toxins, 1999. 5: p. 56-66.

7.         Lipps, B., Small synthetic peptides inhibit, in mice, the lethalithy of toxins derived from animal, plant and bacteria. Journal of Venomous Animals and Toxins, 2000. 6. DOI: 10.1590/S0104-79302000000100005.

8.         Lipps, B.V., Part 1: Lethal Toxin Neutralizing Factor from opossum serum. Toxin Reviews, 2008. 27(2): p. 81-92. DOI: 10.1080/15569540802125449.

9.         Lipps, B., Part 2: Conversion of the active domain of natural opossum lethal toxin neutralizing factor to a synthetic peptide, LT-10. Toxin Reviews, 2008. 27: p. 93-107. DOI: 10.1080/15569540802125480.

10.       Lipps, B.V., PART 3: Elevated Levels Of The Salivary Protein Immunoglobulin E, Nerve Growth Factor, Myoglobin, And Insulin In Patients With Type 2 Diabetes Or With Autoimmunity Can Be Prevented By LT-10-Treatment. Toxin Reviews, 2008. 27(2): p. 109-123. DOI: 10.1080/15569540802125530.

11.       US 20070166775 A1, 2007.

12.       Lipps, B.V., Part 4: Evidence that Lethal Toxin Neutralizing Peptide Lt-10 binds to proteins and an exploration of its potential use in the in vitro assay of toxins. Toxin Reviews, 2008. 27(2): p. 125-138. DOI: 10.1080/15569540802129748.

13.       US 6936423 B1, 2005.

14.       Chavan, S., Deobagkar, D., In silico Molecular Interaction Analysis of LTNF Peptide-LT10 with Snake Venom Enzymes. Protein and peptide letters, 2014. 21: p. 646-656. DOI: 10.2174/0929866521666140320112142.

15.       Hebbi, V., Pandi, K., Kumar, D., Komives, C., Rathore, A., Process for production and purification of Lethal Toxin Neutralizing Factor (LTNF) from E. coli and its economic analysis. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2017. 93: p. 959–967. DOI: 10.1002/jctb.5537.

16.       Contreras, I.J., Expression and Purification of Snake Antivenom Peptide in Pichia pastoris. Master’s Theses. 2019 San Jose State University. p. 54.