Амидирование и ацилирование пептидов по концевым аминокислотным остаткам — распространенные химические модификации, осуществляемые доступными реагентами и позволяющие повысить стабильность препаратов при хранении и в биологических средах. Ацетилированные и амидированные пептиды включают известные препараты: Acetyl-Carnosine, PT-141, Tirzepatide, Taltireline, Oxytocin, а также новые перспективные структуры: Acetyl-Epithalon-Amide (Ac-Epithalon-NH2), Acetyl-Semax-Amide (Ac-Semax-NH2), Acetyl-Selank-Amide (Ac-Selank-NH2). В текущей статье рассмотрены амидирование и ацилирование пептидов и влияние модификаций на их свойства. 

Модифицирование пептидов

Пептиды длиной от 3 до 40 аминокислот составляют основную группу агентов межклеточной коммуникации, работающих либо как гормоны, либо как нейромедиаторы и нейромодуляторы [1]. Пептидные гормоны и нейропептиды синтезируются в виде более крупных белковых предшественников, которые, в зависимости от последовательности и тканевой специфики, расщепляются с образованием биологически активных форм. В этих процессах участвуют несколько ключевых ферментов: сигнальные пептидазы, эндопептидазы — протеинконвертазы, экзопептидазы — карбоксипептидаза H (E), и различные ферменты пептидной модификации. 

Посттрансляционные ферментативные модификации часто необходимы для специфического распознавания пептидов рецепторами и в значительной степени нужны для синтеза биологически активных пептидов. Некоторые пептидные гормоны требуют гликозилирования для проявления полноценной биологической активности. Гормоны передней доли гипофиза, такие как тиреоидстимулирующий гормон (TSH), лютеинизирующий гормон (LH) и фолликулостимулирующий гормон (FSH), являются основными примерами N—гликозилированных биологически активных пептидов. Ацетилирование влияет на биологическую активность пептидов положительно или отрицательно и может увеличить период полураспада пептида in vivo. Ацетилирование меланоцитстимулирующего гормона (α-MSH) и β-эндорфина происходит в секреторных гранулах промежуточной доли гипофиза. Эффект непостоянен: введение ацетильной группы потенцирует активность α-MSH, но отменяет опиатную активность β-эндорфина. Фосфорилирование, по-видимому, не играет критической роли в биологической активности пептидных гормонов. У человека фосфорилируется 33% адренокортикотропинового гормона (АКТГ), тогда как у крыс и коров наблюдается 50% и даже полное отсутствие фосфорилирования, соответственно. Сульфатирование тирозина резко влияет на биологическую активность некоторых нейропептидов. Сульфатирование холецистокинина (CCK) увеличивает эффективность пептида более чем в 200 раз и во многих случаях продлевает период полураспада. 

Известно, что среди посттрансляционных модификаций наиболее важной и необходимой для биологической активности является С-концевое α-амидирование. Эта реакция катализируется бифункциональным ферментом, пептидилглицин α-амидирующей монооксигеназой (PAM, EC 1.14.17.3). PAM катализирует образование пептидного амида из пептидных предшественников, включающих С-концевой глицин, и требует наличия меди, молекулярного кислорода и аскорбата. PAM — единственный фермент, который производит пептидные амиды in vivo. Важность реакции амидирования вытекает из того, что около 50% пептидных гормонов млекопитающих и более 80% гормонов насекомых имеют α-амидированные С-концы [2]. Среди них кальцитонин, окситоцин и вазопрессин, которые в настоящее время широко используются в терапевтических целях. Поскольку терапевтический потенциал амидированных пептидов привлек коммерческое внимание, возросла важность разработки эффективного процесса амидирования для производства этих гормонов. 

Данные, полученные в результате исследований природных модификаций пептидов, легли в основу идеи целенаправленного изменения молекул для обеспечения требуемых свойств. Многие пептиды демонстрируют очень короткий период полураспада in vivo, часто измеряемый минутами, что во многих случаях значительно снижает или исключает достаточную эффективность in vivo. Для достижения длительного периода полураспада, позволяющего использовать комфортный режим дозирования, и при этом сохранить высокую эффективность и нужные свойства препарата, используются различные модификации. Среди распространенных современных модификаций пептидов можно выделить: введение D-аминокислот или неприродных аминокислоты (6-аминокапроновая кислота, аминомасляная кислота, цитруллин, норлейцин и т. д.); циклизацию; фосфорилирование или сульфурилирование (по Ser, Tyr, Thr); биотинилирование; конъюгацию с белками-носителями (BSA, KLH, OVA); разветвление пептидов. 

Рисунок 1 — Пептидные фрагменты для модифицирования 

Пептиды могут быть модифицированы на N—конце, в середине по функциональным группам боковых цепей или на С-конце. В целом, существует несколько фрагментов распространенных пептидных молекул, доступных для модификации: N—концевая аминогруппа; аминогруппы Lys; тиоловая группа Cys; гидроксильные группы Ser, Thr, Tyr; гуанидиновая группа Arg; С-концевая карбоксильная группа (Рисунок 1). Среди наиболее часто используемых модификаций можно выделить активированные эфиры, изотиоцианаты, карбоновые кислоты. Стандартными модификациями аминогрупп являются введение биотина, различных красителей, бифункциональных линкеров, ацильных группы. Среди наиболее часто используемых реагентов для введения модифицирующих групп можно выделить иодоацетамиды, малеимиды и алкилгалогениды. К самым распространенным и востребованным модификациям относятся N—концевое ацетилирование NH₂-группы и С-концевое амидирование кислотной группы (Рисунок 2). 

Рисунок 2 — N-Концевое ацетилирование и С-концевое амидирование пептидов

Для модификации карбоксильной группы (С-концевой участок) могут быть использованы все активные по отношению к ней реагенты: аммиак, амины и их синтоны. В результате образуются соответствующие амиды на C—конце. Ацилирование аминогрупп проводят с помощью ангидридов кислот (простейший из них — уксусный ангидрид), хлорангидридов, смешанных ангидридов и кислот — при использовании с конденсирующих агентом (N,N‘-карбонилдиимидазол, 1,3-дициклогексилкарбодиимид). В некоторых случая модифицируют оба пептидных конца

N-концевое ацетилирование и C-концевое амидирование уменьшают общий заряд пептида, поэтому его общая растворимость в воде может снизиться. Напротив, стабильность пептида может повыситься, поскольку ацетилирование/амидирование на конце воссоздает более близкую имитацию нативного белка, в котором аминокислоты связаны амидными связями. Таким образом, эти модификации способны повысить биологическую активность пептида.

Преимущества модификаций путем N-концевого ацетилирования и C-концевого амидирования следующие:

• Измененные концы пептидов не заряжены, поэтому модифицированные пептиды более точно имитируют нативный белок. Это повышает их способность проникать в клетки. Эта модификация часто используется для проведения экспериментов, анализов in vivo и функциональных исследований in vitro.
• Модификации повышают метаболическую стабильность пептидов, а также их способность противостоять ферментативной деградации аминопетидазами, экзопептидазами и синтетазами. Модифицированные пептиды могут использоваться в исследованиях и разработке лекарственных препаратов.
• Амидирование не только повышает активность пептидных гормонов, но и продлевает срок их хранения.

Далее мы подробнее рассмотрим амидирование и ацилирование пептидов, а также некоторые яркие примеры влияния таких модификаций на биологические свойства молекул.

Амидирование пептидов

В живых организмах амидирование С-конца наблюдается во многих биологически активных пептидах [3]. Амидирование протекает в результате действия фермента пептидилглицин α-амидирующей монооксигеназы (PAM), распознающего дипептиды или трипептиды в белковых последовательностях. В результате пептиды обретают менее ионизируемый С-конец, что дает молекуле больше шансов для проявления биологической активности. Например, усиливается антимикробная активность, когда амидирование С-конца нарушает механизмы деградации белка [4]; возникает нейроактивность, поскольку неамидированные нейропептиды не распознаются клетками нервной системы [2]; активируются пептиды hGLP-1, ответственные за высвобождение инсулина и постпрандиальное снижение уровня глюкозы в плазме [5] и другие.

В лабораториях и в промышленности для синтеза С-концевых амидов пептидов обычно используются смолы для твердофазного синтеза Rink Amide, Pal и Sieber [6]. Эти смолы совместимы с химией защитных групп Fmoc и финальным отщеплением трифторуксусной кислотой (Рисунок 3, А). Для присоединения первого N—защищенного остатка можно использовать стандартные процедуры присоединения пептидов. Эти смолы обычно поставляются с Fmoc-защитой, которая должна быть удалена перед присоединением первого остатка. Короткие пептиды, получаемые в жидкой фазе, могут превращаться в амиды под действием аммиака или его синтонов на этиловый эфир C—конца (Рисунок 3, B). В качестве альтернативы, можно использовать заранее приготовленный амид аминокислоты для дальнейшего синтеза пептида.

Рисунок 3 — Получение С-концевых амидов

Антимикробные пептиды (AMP), короткие молекулы, содержащие до 50 аминокислотных остатков, являются частью врожденной иммунной системы эукариотических организмов и обладают мощной терапевтической активностью против широкого спектра бактерий и грибов. Считается, что способность AMPубивать микроорганизмы зависит от способности воздействовать на мембраны этих организмов, и показано, что некоторые из них проникают в мембрану под углом 30–60º. Поэтому роль пептидного конца может быть решающей для проникновения. Например, изменение С-конца AMP может стабилизировать вторичную структуру и повышать сродство пептида к мембране. В поддержку этого предположения проведен анализ амидированного и неамидированного декапептида аноплина (ANP) в смесях 2,2,2-трифторэтанол (TFE)/вода [7]. Результаты подтвердили предыдущие выводы о том, что амидированный пептид имеет более стабильную α-спиральную конформацию по сравнению с неамидированными изоформами. В работе [4] аналоги ауреиновых AMP, выделенных из австралийской южной лягушки, Litoria aurea, были использованы для изучения роли амидирования в механизме взаимодействия с мембранами. Эти пептиды активны против широкого спектра микроорганизмов, а также демонстрируют противоопухолевую активность. В данном исследовании ауреин 2.6 и 3.1 используются для изучения роли амидирования в механизме мембранного действия с двумя модельными липидными бислоями, которые имитируют мембрану клеток млекопитающих. Амидированный ауреин 2.6-CONH₂ показал вклад в α-спиральную конформацию больше, чем ауреин 2.6-COOH в обеих мембранах. Когда пептиды находятся внутри мембраны, Lys взаимодействует с головной группой липидного бислоя, оставаясь прикрепленным к гидрофильной области поверхности. Такое поведение остатка Lys создает возмущение на мембране, позволяя проникнуть молекулам воды. Макулатин 1.1 (Mac1) — антимикробный пептид из спинных желез австралийских древесных лягушек. Эксперименты показали, что амидирование С-конца привело к более высокой способности разрушать мембрану, а анализы на жизнеспособность бактерий и клеток подтвердили лучшую антибактериальную способность и цитотоксичность амидированной формы по сравнению с кислотной формой Mac1 [8]. При концентрациях 40–60 мкМ выживаемость клеток была почти в сто раз меньше для Mac1-NH₂ против Mac1-COOH

Для многих регуляторных пептидов, включая гастрин и холецистокинин, амидирование необходимо для биологической активности [9]. Глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1) является продуктом эндокринных клеток слизистой оболочки кишечника с инсулинотропным действием, необходимым для поддержания нормальной толерантности к глюкозе. Кроме того, он является мощным ингибитором секреции и моторики верхних отделов желудочно-кишечного тракта и, вероятно, действует как один из гормонов так называемого «подвздошного (илеальный) тормоза» — эндокринного торможения секреции и моторики верхних отделов желудочно-кишечного тракта, вызываемого присутствием питательных веществ в подвздошной кишке. Инкретин и энтерогастроновый гормон GLP-1 существует в амидированной (GLP-1 (7-36) амид; 75%) и глицин-расширенной (GLP-1 (7-37); 25%) форме. Их воздействие на эндокринную систему поджелудочной железы сходно, как и общая скорость выведения. В работе [10] сравнили деградацию двух форм в плазме крови человека при температуре 37ºC in vitro. Значения T_½ составили 32±3 и 42±2 минут для (7-37) и (7-36) амида, соответственно. Разница в метаболизме сохранялась после добавления дипротина А, ингибитора дипептидилпептидазы IV, фермента, ответственного за начальную деградацию GLP-1 в плазме, и более широких ингибиторов фермента. Таким образом, эффектом амидирования GLP-1 является повышение его стабильности в плазме.

Среди уже применяющихся в клинической практике амидированных пептидов — «инкретин двойного действия», тирзепатид (Мунджаро) от компании Eli Lilly, представляет собой линейную молекулу, амидированную по C-концу, с присоединенной через линкер двухосновной жирной кислотой и двумя некодируемыми аминокислотными остатками [11]. Пептидная последовательность и модификации тирзепатида заданы так, чтобы препарат влиял как на рецептор GIPR, так и GLP-1R. Кроме того, структура тирзепатида обладает высокой стабильностью в плазме крови: период полувыведения составляет пять дней, что несопоставимо дольше, чем для GLP-1.

Талтирелин — синтетический аналог тиролиберина (TRH), предназначенный для лечения спиноцеребеллярной атаксией, амидирован по C-концу и обладает высокой стабильностью и продолжительным действием [12, 13]: TRH полностью деградирует в крови пациентов за 30 минут, тогда как ~90% талтирелина сохраняется через 180 минут [14].

Окситоцин, известный препарат, стимулирующий родовую деятельность и применяющийся для предотвращения и лечения маточных кровотечений, содержит амидированные фрагменты глицина и аминокислоты, непосредственно содержащие амидные группы — аспаргин и глутамин [15]. В данном случае амидные группы не являются искусственной модификацией, а содержатся в нативных пептидах. Те же подструктуры характерны для антидиуретического гормона вазопрессина и его синтетического аналога — вазомирина, используемого в терапии несахарного диабета. 

В отличие от меланотана 2 (Ac-Nle-cyclo-(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂), не является амидом бремеланотид (PT-141, Vyleesi, Ac-Nle-cyclo-(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-OH)) — аналог α-меланоцит-стимулирующий гормона (α-MSH), применяющийся для лечения эректильной дисфункции у мужчин и пониженного либидо у женщин [16, 17]. Отсутствие амидирования по C-концу привело к уменьшению побочных эффектов, и хотя принципиально не изменило механизм действия пептида, но повлияло на селективность. Меланотан 2 выступает как неселективный агонист рецепторов MC₁, MC_3–5­­, тогда как бремеланотид более избирателен по отношению к MC₁ и MC₄, при этом бремеланотид теряет свойства по стимуляции меланогенеза в сравнении с меланотан 2.

Ацилирование пептидов

N—концевое ацетилирование белков является одной из основных модификаций эукариотических белков и пептидов [18]. Ее функциональные последствия включают регуляцию белок-белковых взаимодействий и нацеливание на мембраны, а также на стабильность белка и его деградацию. N—концевое ацетилирование (Nα-ацетилирование) в клетках включает перенос ацетильной группы с ацетил-коэнзима А на α-аминогруппу первого аминокислотного остатка белка [19]. Ацетилирование белков также может происходить на Nε-остатках лизина. N—Концевое ацетилирование происходит под действием ряда ацетилтрансфераз, в процессе трансляции белка, посттрансляционно у прокариот и на процессированных регуляторных пептидах эукариот [3]. Эта модификация наблюдается у 85% эукариотических белков и в биологически активных пептидах, таких как человеческий дефенсин-3.

Для синтеза N-ацетилированных пептидов, получаемых путем твердофазного синтеза обычно применяют уксусный ангидрид (Ac₂O) в основных условиях [20] (Рисунок 4, А). Однако этот традиционный метод ацетилирования иногда не обеспечивает достаточно высоких выходов, что сильно зависит от природы целевого пептида. Для повышения выхода ацетилирования обычно используются различные гомогенные и гетерогенные катализаторы. К ним относятся 4-диметиламинопиридин (DMAP), йод, п-толуолсульфокислота, цеолит HSZ-360, различные оксиды металлов, перхлорат железа, адсорбированный на силикагеле, Nafion-H, NBS, ионная жидкость [TMBSA][HSO₄] и др. Использование катализаторов приводит к высоким выходам в случае относительно простых, менее стерически затрудненных малых органических молекул, содержащих аминогруппы. В случае более сложных молекул выходы ниже из-за возможности протекания побочных реакций. Для повышения выходов могут применяться, например, малоновая кислота и кетен в присутствии HBTU. В жидкофазном синтезе коротких пептидов, не несущих лабильные боковые группы, ацетилирование протекает проще, под действием уксусного ангидрида, ацетилхлорида или их синтонов, например, N-ацетил-1H-бензотриазола, в присутствии основания (Рисунок 4, B).

Рисунок 4 — Получение N-ацетилированных пептидов

Экспериментальные данные действительно показали, что белки с ацетилированными N-концами более стабильны in vivo, чем неацетилированные. Одним из объяснений этого может быть то, что другая N-концевая модификация — убиквитинирование, включающая прямое присоединение небольшого белка убиквитина к N-концевому аминокислотному остатку, способствует последующей деградации белка [21]. Таким образом, блокирование N-конца путем ацетилирования потенциально предотвращает N-концевую убиквитинизацию и, следовательно, стабилизирует белок или пептид, как это было продемонстрировано, например, для p16 и p14/p19ARF. Однако неацетилированный N-конец все же может способствовать дестабилизации белка по механизму, не зависящему от убиквитина. Кроме того, было обнаружено, что N-ацетилированные аминокислотные последовательности в некоторых белках участвуют в создании сигналов деградации [22]: убиквитин-лигаза Doa10 распознает N-ацетилированные белки и помечает их убиквитином для последующего разрушения. Исследование обнаружило этот класс сигналов деградации в восьми дрожжевых белках, что указывает на общность этого явления, по крайней мере, в подгруппе дрожжевых белков, 

Пептиды являются промежуточными продуктами в процессе распада белка. Исследования стабильности белков и пептидов под действием ферментов микроорганизмов в рубце животных, где преобладающим механизмом гидролиза является дипептидил-аминопептидазная активность, которая расщепляет дипептиды с N-конца цепи, показали, что ацетилирование с помощью уксусного ангидрида способно повысить стабильность [23]. Влияние ацетилирования на расщепление пептидов и производство аммиака определялось путем инкубации немодифицированных и ацетилированных субстратов с микроорганизмами рубца овец in vitro. Ацетилирование мало повлияло на производство аммиака, продукта гидролиза, из казеина и лактальбумина, но ацетилирование соответствующих ферментативных гидролизатов привело к снижению производства аммиака более чем в два раза после 3–6 часов инкубации. Оценка количества пептидов, оставшихся в рубцовой жидкости, показала, что снижение производства аммиака было следствием того, что пептиды гидролизовались медленнее. Ацетилированные Ala-Ala, Ala-Ala-Ala, Leu-Gly-Gly, Phe-Gly-Gly и Val-Gly-Ser-Glu выдерживали инкубацию с рубцовой жидкостью in vitro в течение 6 часов, тогда как соответствующие немодифицированные пептиды практически полностью разложились за это время. Защита более крупных чистых пептидов была менее эффективной: например, 72% ацетилированного брадикинина было гидролизовано через 1 час, тогда как немодифицированный препарат разлагался полностью. В целом, ацетилированные пептиды расщеплялись медленнее, чем немодифицированные, но полного ингибирования активности пептидаз не происходило.

Пептид YY (PYY_1-36) содержит 36 аминокислотных остатков и выделяется вместе с GLP-1 из L-клеток в дистальном отделе кишечника человека в ответ на поступление питательных веществ. Он входит в семейство пептидов, включающее нейропептид Y (NPY) и панкреатический полипептид (PP), и рассматривается как потенциальное средство для лечения ожирения и диабета.[24]. Главным недостатком пептида является низкая стабильность — период полураспада составляет менее 10 минут. Присоединение жирных дикислот С14–20 к пептиду PYY3-36 позволило значительно увеличить период полураспада, до 9–120 часов, в зависимости от длины кислотной цепи и места ее присоединения. Однако модификации в несколько раз снизили биологическую активность пептида. Несмотря на это, эксперименты показали, что ацилированный PYY3-36 с заместителями на Lys4, Arg4, Asn18 и Gln18 в комбинации с аналогом GLP-1, лираглутидом, может вызывать дополнительную потерю веса в модели ожирением на карликовых свиньях in vivo. 

Дипептид L-карнозин исследуется как как потенциальное средство против нейродегенеративных заболеваний, как геропротектор и антиоксидант [25]. N-Ацетилкарнозин (NAC) — одно из самых продаваемых производных карнозина, применяемое в офтальмологической практике [26]. NAC более эффективнее проникает через плотную оболочку глазного яблока, а также характеризуется замедленным гидролизом, протекающим за 15–30 минут [27]. Для сравнения, период полураспада немодифицированного соединения составляет менее 14 минут [28].

Ноотропный нейропептид семакс в ацетилированной форме (Ac-Semax) демонстрирует повышенную стабильность по отношению к лейцин-аминопептидазе: за 60 часов Семакс деградирует на 99,2 %, а модифицированный пептид сохраняется практически полностью, что, как считают исследователи, способствует пролонгации ноотропных его эффектов [29, 30].

N-Ацетилирование применяют не только для модификации пептидов, но и аминокислот. Известным примером является N-ацетил-L-цистеин, использующийся как муколитик. Ацетильная группа придает большую стабильность по отношению к окислителям, при этом снижается токсичность препарата [31].

Кроме уксусной кислоты, в пептиды синтетически вводят и другие остатки кислот: муравьиной, янтарной, малеиновой, липоевой, 4-гидроксифенилпропионовой, масляной и др. Пептиды, предназначенные для нанесения на кожу в косметических или лечебных целях, ацилируют фрагментами жирных кислот с длинным углеводородными цепочками: гексановой, октановой, декановой, пальмитиновой стеариновой, лауриновой и миристиновой. Неполярные остатки кислот повышают способность пептидов проникать через кожу и повышают их растворимость в тканях, богатых жирами. Среди модифицированных пептидов — ацетил тетрапептид-3, входящий в средства для ухода за волосами, ацетил октапептид-3, улучшающий состояние кожи, противоморщинный ацетил гексапептид-3, запускающий восстановительные процессы пальмитоил пентапептид-4, антивозрастные пальмитоил дипептид-7, пальмитоил гексапептид-12, Pal-GHK и многие другие.

Заключение

Химические модификации пептидов и белков являются распространенным средства управления их функциями. Амидирование и ацилирование пептидов по концевым аминокислотным остаткам относится и наиболее доступным способам увеличения их стабильности как при хранении, так и в биологических средах, повышению проникающий способности. Оба процесса протекают в организмах человека и животных в естественных условиях. Как синтетические методы, эти подходы применяются для модификации лекарственных, косметических и других полезных пептидов. В целом, амидирование и ацилирование служат удобными инструментами для регулирования свойств пептидов.

1.         Kim, K.-H., Seong, B.L., Peptide amidation: Production of peptide hormonesin vivo andin vitro. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2001. 6(4): p. 244-251. DOI: 10.1007/BF02931985.

2.         Eipper, B.A., Stoffers, D.A., Mains, R.E., The biosynthesis of neuropeptides: peptide alpha-amidation. Annual review of neuroscience, 1992. 15(1): p. 57-85.

3.         de Paula Oliveira Santos, B., Silva, B.M., de Magalhães, M.T.Q., Workflow for Protein N-terminal Acetylation and C-terminal Amidation Application using CcpNmr Analysis v2.4 Platform and Aria2.3 Structure Calculation Software.bioRxiv, 2020: p. 2020.2012.2008.414565. DOI: 10.1101/2020.12.08.414565.

4.         Mura, M., Wang, J., Zhou, Y., Pinna, M., Zvelindovsky, A.V., Dennison, S.R., Phoenix, D.A., The effect of amidation on the behaviour of antimicrobial peptides. European Biophysics Journal, 2016. 45(3): p. 195-207.

5.         Zhang, Z.-Z., Yang, S.-S., Dou, H., Mao, J.-F., Li, K.-S., Expression, purification, and C-terminal amidation of recombinant human glucagon-like peptide-1. Protein expression and purification, 2004. 36(2): p. 292-299.

6.         Amblard, M., Fehrentz, J.-A., Martinez, J., Subra, G., Methods and protocols of modern solid phase peptide synthesis. Molecular biotechnology, 2006. 33(3): p. 239-254.

7.         Dos Santos Cabrera, M.P., Arcisio‐Miranda, M., Broggio Costa, S.T., Konno, K., Ruggiero, J.R., Procopio, J., Ruggiero Neto, J., Study of the mechanism of action of anoplin, a helical antimicrobial decapeptide with ion channel‐like activity, and the role of the amidated C‐terminus. Journal of Peptide Science: An Official Publication of the European Peptide Society, 2008. 14(6): p. 661-669.

8.         Zhu, S., Li, W., O’Brien-Simpson, N., Separovic, F., Sani, M.-A., C-terminus amidation influences biological activity and membrane interaction of maculatin 1.1. Amino Acids, 2021. 53(5): p. 769-777. DOI: 10.1007/s00726-021-02983-z.

9.         Kreil, G., [21] Occurrence, detection, and biosynthesis of carboxy-terminal amides, in Methods in Enzymology. 1984, Elsevier. p. 218-223.

10.       Wettergren, A., Pridal, L., Wøjdemann, M., Holst, J.J., Amidated and non-amidated glucagon-like peptide-1 (GLP-1): non-pancreatic effects (cephalic phase acid secretion) and stability in plasma in humans. Regulatory Peptides, 1998. 77(1): p. 83-87. DOI: https://doi.org/10.1016/S0167-0115(98)00044-5.

11.       Coskun, T., Sloop, K.W., Loghin, C., Alsina-Fernandez, J., Urva, S., Bokvist, K.B., Cui, X., Briere, D.A., Cabrera, O., Roell, W.C., Kuchibhotla, U., Moyers, J.S., Benson, C.T., Gimeno, R.E., D’Alessio, D.A., Haupt, A., LY3298176, a novel dual GIP and GLP-1 receptor agonist for the treatment of type 2 diabetes mellitus: From discovery to clinical proof of concept. Molecular Metabolism, 2018. 18: p. 3-14. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molmet.2018.09.009.

12.       Fukuchi, I., Asahi, T., Kawashima, K., Kawashima, Y., Yamamura, M., Matsuoka, Y., Kinoshita, K., Effects of taltirelin hydrate (TA-0910), a novel thyrotropin-releasing hormone analog, on in vivo dopamine release and turnover in rat brain. Arzneimittelforschung, 1998. 48(4): p. 353-359.

13.       Asai, H., Asahi, T., Yamamura, M., Yamauchi-Kohno, R., Saito, A., Lack of behavioral tolerance by repeated treatment with taltirelin hydrate, a thyrotropin-releasing hormone analog, in rats. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 2005. 82(4): p. 646-651. DOI: https://doi.org/10.1016/j.pbb.2005.11.004.

14.       Kinoshita, K., Yamamura, M., Sugihara, J., Suzuki, M., Matsuoka, Y., Taltirelin Hydrate (TA-0910): An Orally Active Thyrotropin-Releasing Hormone Mimetic Agent with Multiple Actions. CNS Drug Reviews, 1998. 4(1): p. 25-41. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1527-3458.1998.tb00039.x.

15.       Sewald, N., Jakubke, H.-D., Peptides from A to Z. A Concise Encyclopedia. 2008, Darmstadt: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. p. 400.

16.       King, S.H., Mayorov, A.V., Balse-Srinivasan, P., Hruby, V.J., Vanderah, T.W., Wessells, H., Melanocortin receptors, melanotropic peptides and penile erection. Current topics in medicinal chemistry, 2007. 7(11): p. 1111-1119. DOI: 10.2174/1568026610707011111.

17.       He, S., Ye, Z., Dobbelaar, P.H., Sebhat, I.K., Guo, L., Liu, J., Jian, T., Lai, Y., Franklin, C.L., Bakshi, R.K., Dellureficio, J.P., Hong, Q., Tsou, N.N., Ball, R.G., Cashen, D.E., Martin, W.J., Weinberg, D.H., MacNeil, T., Tang, R., Tamvakopoulos, C., Peng, Q., Miller, R.R., Stearns, R.A., Chen, H.Y., Chen, A.S., Strack, A.M., Fong, T.M., MacIntyre, D.E., Wyvratt, M.J., Nargund, R.P., Discovery of a spiroindane based compound as a potent, selective, orally bioavailable melanocortin subtype-4 receptor agonist. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2010. 20(7): p. 2106-2110. DOI: 10.1016/j.bmcl.2010.02.058.

18.       Arnesen, T., Towards a functional understanding of protein N-terminal acetylation. PLoS biology, 2011. 9(5): p. e1001074.

19.       Arnesen, T., Van Damme, P., Polevoda, B., Helsens, K., Evjenth, R., Colaert, N., Varhaug, J.E., Vandekerckhove, J., Lillehaug, J.R., Sherman, F., Proteomics analyses reveal the evolutionary conservation and divergence of N-terminal acetyltransferases from yeast and humans. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009. 106(20): p. 8157-8162.

20.       Chandra, K., Roy, T.K., Naoum, J.N., Gilon, C., Gerber, R.B., Friedler, A., A highly efficient in situ N-acetylation approach for solid phase synthesis. Organic & Biomolecular Chemistry, 2014. 12(12): p. 1879-1884. DOI: 10.1039/C3OB42096E.

21.       Ben-Saadon, R., Fajerman, I., Ziv, T., Hellman, U., Schwartz, A.L., Ciechanover, A., The tumor suppressor protein p16INK4a and the human papillomavirus oncoprotein-58 E7 are naturally occurring lysine-less proteins that are degraded by the ubiquitin system: Direct evidence for ubiquitination at the N-terminal residue. Journal of Biological Chemistry, 2004. 279(40): p. 41414-41421.

22.       Hwang, C.-S., Shemorry, A., Varshavsky, A., N-terminal acetylation of cellular proteins creates specific degradation signals. Science, 2010. 327(5968): p. 973-977.

23.       Wallace, R.J., Acetylation of peptides inhibits their degradation by rumen micro-organisms. British Journal of Nutrition, 1992. 68(2): p. 365-372. DOI: 10.1079/BJN19920095.

24.       Østergaard, S., Paulsson, J.F., Kofoed, J., Zosel, F., Olsen, J., Jeppesen, C.B., Spetzler, J., Ynddal, L., Schleiss, L.G., Christoffersen, B.Ø., Raun, K., Sensfuss, U., Nielsen, F.S., Jørgensen, R., Wulff, B.S., The effect of fatty diacid acylation of human PYY3-36 on Y2 receptor potency and half-life in minipigs. Scientific Reports, 2021. 11(1): p. 21179. DOI: 10.1038/s41598-021-00654-3.

25.       Europe L-Carnosine Market 2020-2026. 2020; Available from: https://www.giiresearch.com/report/omr962316-europe-l-carnosine-market.html.

26.       Babizhayev, M.A., Deyev, A.I., Yermakova, V.N., Semiletov, Y.A., Davydova, N.G., Doroshenko, V.S., Zhukotskii, A.V., Goldman, I.M., Efficacy of N-Acetylcarnosine in the Treatment of Cataracts. Drugs in R & D, 2002. 3(2): p. 87-103. DOI: 10.2165/00126839-200203020-00004.

27.       Babizhayev, M.A., Yermakova, V.N., Sakina, N.L., Evstigneeva, R.P., Rozhkova, E.A., Zheltukhina, G.A., Nα-Acetylcarnosine is a prodrug of L-carnosine in ophthalmic application as antioxidant. Clinica Chimica Acta, 1996. 254(1): p. 1-21. DOI: https://doi.org/10.1016/0009-8981(96)06356-5.

28.       Aldini, G., Orioli, M., Rossoni, G., Savi, F., Braidotti, P., Vistoli, G., Yeum, K.-J., Negrisoli, G., Carini, M., The carbonyl scavenger carnosine ameliorates dyslipidaemia and renal function in Zucker obese rats. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2011. 15(6): p. 1339-1354. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1582-4934.2010.01101.x.

29.       Shevchenko, K.V., Nagaev, I.Y., Andreeva, L.A., Shevchenko, V.P., Myasoedov, N.F., Stability of Semax acetyl to proteolysis in various biological media. Doklady Biological Sciences, 2013. 449(1): p. 110-112.

30.       Magrì, A., Tabbì, G., Giuffrida, A., Pappalardo, G., Satriano, C., Naletova, I., Nicoletti, V.G., Attanasio, F., Influence of the N-terminus acetylation of Semax, a synthetic analog of ACTH(4-10), on copper(II) and zinc(II) coordination and biological properties. Journal of Inorganic Biochemistry, 2016. 164: p. 59-69. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2016.08.013.

31.       Atkuri, K.R., Mantovani, J.J., Herzenberg, L.A., Herzenberg, L.A., N-Acetylcysteine—a safe antidote for cysteine/glutathione deficiency. Current Opinion in Pharmacology, 2007. 7(4): p. 355-359. DOI: https://doi.org/10.1016/j.coph.2007.04.005.