Андрогенная алопеция – самый распространенный тип потери волос, встречаемость которого у мужчин 65–69 лет достигает 53%. Следствием алопеции могут быть стресс, тревожность, снижение самооценки и депрессия.  Известные препараты финастерид и миноксидил обладают низкой эффективностью и нежелательными побочными эффектами. В Корее был разработан уникальный полипептид PTD-DBM, эффективно стимулирующий регенерацию волосяного покрова, особенно в сочетании с вальпроевой кислотой и предварительной обработкой кожи с помощью микроигл.  Кроме того, пептид оказывает мощное ранозаживляющее действие. В настоящем обзоре рассмотрены результаты биологических испытаний PTD-DBM на животных in vivo и на клетках человека ex vivo, а также молекулярно-биологические механизмы его действия.

Волосы человека с возрастом, как правило, становятся более тонкими и ломкими. В среднем, волосы на голове растут со скоростью менее чем на полтора сантиметра в месяц. Причиной выпадения волос является, в значительной степени, наследственность, но также неблагоприятно влияет естественная инактивация волосяных фолликулов при снижении уровня гормонов, которые контролируют рост волос, формирование их текстуры и запуск процесса поседения. Волосяные фолликулы при андрогенной алопеции (мужской тип облысение, AGA) имеют чрезмерную активность фермента 5α-редуктазы и повышенные уровни дигидротестостерона (DHT) [1]. Количество человеческих волос составляет 100–150 тыс. штук, и каждый волос имеет свой цикл развития. В фазе роста волосы происходит образование кератина, а в фазе дегенерации волос растет медленно, поскольку замедляется метаболизм при сохранении формы волос. В дегенеративном периоде кератин не вырабатывается, и деление клеток волосяных фолликулов прекращается. В следующей фазе волосяные фолликулы перестают быть активными и готовы к выпадению волос, которое сопровождается выталкиванием вновь растущими волосами у его основания. Этот цикл повторяется в течение трех–шести лет, что приводит к нормальной потере ~100 волос в день. Однако, по мере прогрессирования облысения, фолликулы в корнях волос становятся меньше, и, при развитии этого процесса, волос становится тоньше, а их длина – короче. Цикл жизни волос также сокращается. При облысении сальные железы постепенно становятся больше, жирность кожи головы увеличивается, вызывая себорейный дерматит и способствуя потере волос.

Андрогенная алопеция является наиболее распространенным типом потери волос как у мужчин, так и у женщин. Облысение происходит у большого процента взрослых людей и прогрессирует с возрастом. Так, встречаемость алопеции у мужчин возраста 40–55 лет составляет 31% и достигает 53% в 65–69 лет. Андрогенная алопеция является не только косметическим дефектом, но серьезной проблемой, поскольку может вызывать психологический стресс, тревожность, снижение самооценки и депрессию. Ингибитор 5α-редуктазы финастерид и применяемый местно сосудорасширяющий препарат миноксидил являются единственными одобренными Управлением по контролю качества продуктов и лекарств США (FDA) средствами для лечения алопеции, но их применение ограничено низкой эффективностью и потенциально нежелательными побочными эффектами. В связи с этим сохраняется актуальность разработки новых препаратов для борьбы с облысением, обладающих более привлекательным биологическим профилем.

PTD-DBM (PolyR8-HFAP) – синтетический пептид с массой 3082,65 Да и аминокислотной последовательностью RRRRRRRRGGGGRKTGHQICKFRKC. Название вещества происходит из сокращения от «домен трансдукции белка» (PTD)-«Dvl-связывающий мотив» (DBM), (Protein transduction domain-Dvl-binding motif). Фрагмент RKTGHQICKFRKC аминокислотной последовательности PTD-DBM соответствует пептиду DBM (минимального связывания Dvl), который является частью белков CXXC4 и CXXC5, присутствующих в организме человека. Пептид DBM ингибирует взаимодействие между Idbf (ингибитором Dv1 и образования кости, CXXC5) и Dvl (белок Dishevelled), тем самым активируя путь передачи сигнала Wnt/β-катенин [2]. Отметим, что в настоящее время запатентовано порядка 30 различных модификаций родоначальной последовательности RKTGHQICKFRKC [2-4]. Другое часто встречаемое название пептида, PolyR8-HFAP, основано на его структурных особенностях. Поли- означает R8 (8 остатков аргинина, RRRRRRRR) и полиглициновый линкер (GGGG) на N-конце активной последовательности пептида, активирующего волосяной фолликул (Hair Follicle Activating Peptide) RKTGHQICKFRKC [3]. Полиаминокислотный фрагмент служит для улучшения способность молекулы проникать через защитный слой кожи.

PTD-DBM был разработан и запатентован как средство для регенерации фолликулов в 2014 году группой исследователей под руководством проф. Чой Кан-Йоль (Choi Kang-yeol) в Университете Ёнсе (Сеул, Южная Корея) [3]. Ученым удалось обнаружить белок, ответственный за выпадение волос при как андрогенной алопеции. Этот белок контролирует рост волос, а новое вещество, воздействуя с ним, модулирует функцию и способствует регенерации волос. Указанный полипептид называется белком цинкового пальца CXXC-типа 5 (CXXC5 – CXXC-type zinc finger protein 5), действующий как негативный регулятор сигнального пути Wnt/β-катенин, который связан с регенерацией волос и заживлением ран. CXXC5 связывается с белком Dishevelled и предотвращает развитие фолликулов и отрастание волос. Доказано, что этот путь способствует миниатюризации волосяных фолликулов, вызванной DHT. Это знание привело к разработке нового биохимического вещества, PTD-DBM, которое мешает данному процессу связывания. Многие исследователи считают, что сигнальные внутриклеточные пути Wnt ответственны за развитие волосяного фолликула и регенерацию волос у людей.

В исследованиях на животных была четко продемонстрирована положительная роль пути Wnt/β-катенин в дифференцировке остеобластов и поддержании минеральной плотности кости.

Эксперименты на мышах, описанные в патенте [3] показывают, что рост волос стимулируется на коже мышей, обработанных PTD-DBM (Рис. 1).

Рисунок 1 – волосяной покров мышей и микроскопическое изображение среза кожи (контроль – верх, обработанные PTD-DBM – низ)

Чтобы подтвердить влияния пептида на стимулирование роста волос, в эксперименте удаляли волосы на задней части мышей. Контрольной группе выбритую зону обрабатывали водно-спиртовым раствором, экспериментальной – один раз в день в течение 25 дней раствором 50 мкл пептида и вальпроевой кислоты (VPA, 2-пропилпентановая кислота, лекарственное средство с противоэпилептическим действием, которое в данном использовали местно для активации пути Wnt/β-катенин) в концентрации 40 мМ и 500 мМ соответственно. В результате было обнаружено, что рост волос стимулировался в группе, обработанной VPA и пептидом, по сравнению с контрольной, и увеличение роста было значительным. Кожную ткань подопытных мышей фиксировали, помещали в парафин и нарезали до толщины 4 мкм. После обработки и окрашивания, авторы исследовали гистологию срезов под микроскопом (Рис. 1). В результате наблюдения было подтверждено, что волосяные фолликулы в фазе роста были обнаружены в группе, обработанной пептидом и VPA. В случае PTD-DBM скорость роста волосяных фолликулов была увеличена примерно в три раза по сравнению с только VPA. Методом флюоресцентной микроскопии были определены маркеры эпидермальной дифференцировки – лорикрин, филагрин, кератин, которые, как известно, увеличивают рост волос. Таким образом было подтверждено, что экспрессия этих маркеров была значительно увеличена (почти в 30 раз) в ткани кожи, обработанной пептидом PTD-DBM.

В 2015 году было запатентовано применение PTD-DBM в качестве эффективного ранозаживляющего средства [2]. Согласно формуле изобретения, кератиноциты и фибробласты, которые играют важную роль в заживлении ран, обрабатывали композицией, содержащей полипептид PTD-DBM. В результате эксперимента было подтверждено, что пептид хорошо проникал в клетки и увеличивал содержание β-катенина пропорционально концентрации активного вещества. Кератиноциты в эпидермисе образуют базальный и роговой слои кожи. На скорость заживления ран, среди других факторов, влияют пролиферация и скорость миграции кератиноцитов. Полипептид оказался эффективен при заживлении ран, так как он хорошо проникает в кератиноциты и повышает уровень β-катенина. Композиция для ускорения заживления ран может дополнительно содержать VPA, производные индирубина, хлорид лития и т. д. Такое сочетание ускоряет повторную эпителизацию острой раны и приводит к увеличению маркеров заживления.

Чтобы подтвердить эффект пептида на стимулирование заживления ран, удаляли волосы на спине мышей и наносили рану размером 1,5×1,5 см. Контрольной группе наносили 10 мкл водно-спиртового раствора один раз в день в течение 12 дней. На испытуемой группе применяли 10 мкл аналогичного раствора, содержащего пептид или VPA в концентрациях 100 мкМ и 500 мМ, соответственно. Ткань кожи мышей фиксировали, помещали в парафин и нарезали толщиной 4 мкм, затем, после соответствующей обработки, исследовали гистологическую структуру. Методом иммуногистохимического окрашивания в качестве маркеров заживления ран определяли уровни β-катенина, кератина 14 и коллагена I. Как видно из рисунка 2, PTD-DBM может быстро излечивать острую рану на мышиной модели; эффект PTD-DBM синергически улучшается, когда его используют в комбинации с VPA.

Рисунок 2 – Ранозаживление с PTD-DBM (справа), контроль (слева)

Эти результаты также раскрыты авторами патента [2] в статье [5], с акцентом на молекулярно-биологические аспекты ранозаживления. Также приводится информация о том, что PTD-DBM индуцирует выработку коллагена в фибробластах кожи человека ex vivo. Число клеток, которые мигрировали в поврежденной области кожи, были значительно увеличено. Кроме того, фибробласты, обработанные PTD-DBM, показали увеличенные стрессовые волокна и более толстую кортикальную сеть по сравнению с контрольными фибробластами.

Механизм действия пептида PTD-DBM можно понять, рассмотрев сигнальные пути ранозаживления. Белок цинкового пальца CXXC5, ранее идентифицированный как негативный регулятор пути Wnt/β-катенин, показал в предыдущих исследованиях измененную в зависимости от типа клеток функцию и клеточную локализацию. Однако функция CXXC5 in vivo еще не была четко исследована. Авторы [6] охарактеризовали CXXC5 как негативный регулятор дифференцировки остеобластов и формирования кости. Дефицит CXXC5 приводил к увеличению механической плотности костей у мышей. CXXC5 показывал влияние отрицательной обратной связи на путь Wnt/β-катенин посредством Wnt-зависимого связывания с Dishevelled (Dvl) во время дифференцировки остеобластов. Подавление взаимодействия Dvl-CXXC5 с использованием конкурирующего пептида привело к активации пути Wnt/β-катенин и дифференцировке остеобластов, а также к ускоренному росту толщины культивированных ex vivo клеток из свода черепа. В целом, CXXC5 является регулятором отрицательной обратной связи, индуцированной передачей сигналов Wnt/β-катенин. У человека уровни CXXC5 снижаются при острых ранах. Чтобы идентифицировать участие CXXC5 в заживлении кожных ран на человеческой модели, авторы [5] исследовали состояние CXXC5 в хирургических ранах после удаления меланом, для чего контролировали с помощью иммуногистохимического анализа уровни маркеров β-катенина и CXXC5 во время процесса заживления раны в течение 3 месяцев в образцах раневой ткани от пяти пациентов. Уровни белка β-катенина постепенно повышались и достигали пика через 28 дней после операции. Экспрессия кератина 14, коллагена I и ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) напрямую связана с экспрессией β-катенина во время заживления ран [5]. CXXC5 ингибирует выработку коллагена in vitro. у CXXC-нокдаунных мышей наблюдается ускоренное заживление кожных ран и усиление синтеза кератина 14 и коллагена I. Скорость закрытия раны у таких мышей была увеличена на 16–32% по сравнению с таковой у нормальных мышей во время пролиферативной фазы заживления ран.

В 2017 году были опубликованы результаты исследования, в котором авторы наблюдали за уровнями CXXC5 на волосатой и лысой коже головы от пяти пациентов с андрогенной алопецией и охарактеризовали влияние пептида PTD-DBM, нарушающего взаимодействие CXXC5-Dvl на экспрессию ALP in vitro и in vivo и на рост волос [1]. Образцы были получены от одних и тех же людей с алопецией при помощи биопсии. Чтобы исследовать клиническое значение передачи сигналов Wnt/β-катенин и CXXC5, авторы контролировали уровни этих белков в волосатой и лысой коже головы. Высокая экспрессия и ядерная локализация β-катенина наблюдалась в клетках матрикса волосистой части, но его экспрессия была ниже в лысой коже. И наоборот, нормальный волосяной фолликул демонстрировал слабую или нулевую экспрессию CXXC5, тогда как она была высокой в миниатюрных фолликулах лысой кожи головы. CXXC5 также был высоко экспрессирован в кожных сосочках, а также в фолликулярных кератиноцитах лысой кожи головы, находящихся в фазе катагена. Пролиферирующие клеточные ядерные антиген (PCNA)-позитивные клетки были видны посредством иммуногистохимии среди матричных кератиноцитов в волосистой части головы, но количество PCNA-позитивных клеток было значительно уменьшено в лысой коже. Хотя ALP был сильно экспрессирован в клетках по направлению к вершине кожного сосочка в волосистой части головы, его экспрессия не обнаруживалась в лысой коже. Маркер кератина 15 стволовых клеток волосяного фолликула и маркеры клеток-предшественников, таких как CD34 и CD200, были, в основном, экспрессированы в клетках наружного корня волосистой части головы. Экспрессия кератина 15 была сохранена в фолликулах лысой кожи головы, в то время как CD34 и CD200 обнаружены не были. Количественный анализ иммуногистохимического окрашивания также подтвердил закономерности обратной экспрессии β-катенина и CXXC5 в терминальных и миниатюризированных фолликулах пациентов с алопецией. CXXC5 был высоко экспрессирован в кератиноцитах миниатюрных фолликулов и мышцах arrector pili по сравнению с его экспрессией в сальных железах. Кроме того, CXXC5 экспрессируется в кератин 15-негативных клетках фолликулов в лысой коже головы. Экспрессия β-катенина достигла максимума на 10-й день после депиляции, впоследствии экспрессия CXXC5 стала максимумальной на 18-й день. Учитывая обратную связь между экспрессией β-катенина и CXXC5, было предположено, что последующая индукция CXXC5 может быть механизмом отрицательной обратной связи пути Wnt/β-катенина.

В эксперименте на животных [1], мышей, чьи волосяные фолликулы находились в фазе телогена, анестезировали, а их спины обривали машинкой для стрижки волос. Затем местно наносили ежедневно в течение 28 дней по 100 мкл каждого препарата в следующей концентрации: только PTD-DBM (2 мМ), только VPA (500 мМ), PTD-DBM и VPA в комбинации или только миноксидил (100 мМ). В качестве контроля, одну группу мышей обрабатывали водно-спиртовым раствором. В результате была показана синергетическая эффективность комбинации PTD-DBM и VPA (Рис. 3). Минокседил действовал сопоставимо с VPA.

Рисунок 3 – Стимуляция роста волос на мышах [1]

В модели индуцированного раной восстановления (WIHN) волосяных фолликулов на спины мышей были нанесены раны с полной площадью 1 см². Пятнадцать микролитров каждого препарата в той же концентрации, что и в экспериментах по росту волос, наносили на раны ежедневно в течение 13 дней.

Здесь стоит отметить, что примененный авторами [1] подход WIHN основан на том, что в коже взрослых млекопитающих в центре крупных полноразмерных иссеченных ран волосяные фолликулы регенерируются естественным образом. Это явление было впервые обнаружено более 50 лет назад на животных моделях, но за последнее десятилетие, благодаря более глубокому пониманию молекулярного механизма, интерес к нему значительно усилился [7]. Регенерация волосяных фолликулов de novo в значительной степени повторяет эмбриональное развитие волос, требуя канонической передачи сигналов Wnt в эпидермисе, однако есть и важные различия. Опосредованная TLR3 чувствительность двухцепочечной РНК является критической для регенерации, активируя передачу сигналов ретиноевой кислоты после повреждения тканей. Воспалительные клетки, Т-клетки и макрофаги, также становятся важными медиаторами WIHN. Кроме того, передача сигналов Shh, играющая важную роль в развитии эмбриональных волосяных фолликулов, участвует и в WIHN, перенаправляя клетки в регенеративный фенотип. Также, многочисленные популяции стволовых клеток вносят свой вклад в регенерацию, вызываемую WIHN. Технически, WIHN обычно включает в себя аппликацию или прокатывание роликов с очень тонкими иглами по коже, чтобы проколоть ее. Такое устройство называются дермароллер.

В целом, CXXC5 высоко экспрессируется в миниатюрных фолликулах волосистой части головы человека и катагенных фолликулах в коже мышей, что позволяет предположить, что CXXC5 отрицательно регулирует рост волос у людей и мышей [1]. Снижение активности CXXC5 способствует регенерации волос в нормальной и раненной коже, а обработка VPA дополнительно индуцирует фенотип CXXC5-дефицитных мышей. Комбинированное применение PTD-DBM синергически индуцирует экспрессию β-катенина, ALP и PCNA фолликулами человека. Авторы также наблюдали синергетическое увеличение репортерной активности Wnt и ALPL, как и активности ALP фолликул человека, обработанных PTD-DBM. Кроме того, пролиферация клеток была значительно увеличена через 72 часа после обработки PTD-DBM. Совместное применение PTD-DBM и VPA способствует росту волос и значительно индуцирует экспрессию β-катенина и Fgf9 в ранах мышей. Эти данные указывают на то, что блокада взаимодействия CXXC5-Dvl является возможной стратегией для разработки новых лекарств, которые усиливают регенерацию волосяного фолликула.

Таким образом, есть три составляющие возможного подхода для лечения алопеции. Раны от микроигл стимулируют образование фолликулов, вальпроевая кислота активирует клеточный путь, связанный с развитием фолликулов, а пептид PTD-DBM предотвращает негативное вмешательство белка CXXC5 в процесс развития фолликула. Исследования показали, что PTD-DBM значительно более эффективно стимулирует регенерацию волос в сочетании с вальпроевой кислотой при местном применении. Эту комбинацию оптимально применять после воздействия микроигл, чтобы воспользоваться их действием на развитие фолликула. Кроме того, дальнейшее изучение WIHN позволит раскрыть ключевые этапы развития и регенерации млекопитающих, что может привести к новым клиническим методам лечения ран и алопеции. Пептид PTD-DBM и вальпроевая кислота поставляются через интернет-магазины в аэрозольных баллончиках и рекомендуются производителями для ежедневного нанесения на кожу головы; дермороллеры с микроиглами обычно используются 1–2 раза в неделю. Однако потенциальным потребителям следует с осторожностью относиться к этой информации, поскольку метод еще не получил официального одобрения регулирующих организаций.

1.         Lee, S.-H., Seo, S.H., Lee, D.-H., Pi, L.-Q., Lee, W.-S., Choi, K.-Y., Targeting of CXXC5 by a Competing Peptide Stimulates Hair Regrowth and Wound-Induced Hair Neogenesis. Journal of Investigative Dermatology, 2017. 137(11): p. 2260-2269. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jid.2017.04.038.

2.         US 20150224167 A1, 2015.

3.         WO 2014073919 A1, 2014.

4.         US 9150630 B2, 2015.

5.         Lee, S.-H., Kim, M.-Y., Kim, H.-Y., Lee, Y.-M., Kim, H., Nam, K.A., Roh, M.R., Min, D.S., Chung, K.Y., Choi, K.-Y., The Dishevelled-binding protein CXXC5 negatively regulates cutaneous wound healing. Journal of Experimental Medicine, 2015. 212(7): p. 1061-1080. DOI: 10.1084/jem.20141601.

6.         Kim, H.Y., Yoon, J.Y., Yun, J.H., Cho, K.W., Lee, S.H., Rhee, Y.M., Jung, H.S., Lim, H.J., Lee, H., Choi, J., Heo, J.N., Lee, W., No, K.T., Min, D., Choi, K.Y., CXXC5 is a negative-feedback regulator of the Wnt/β-catenin pathway involved in osteoblast differentiation. Cell Death & Differentiation, 2015. 22(6): p. 912-920. DOI: 10.1038/cdd.2014.238.

7.         Wier, E.M., Garza, L.A., Through the lens of hair follicle neogenesis, a new focus on mechanisms of skin regeneration after wounding. Seminars in Cell & Developmental Biology, 2020. 100: p. 122-129. DOI: https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2019.10.002.