PNC-27 —новый синтетический противораковый пептид, содержащий активный фрагмент и вспомогательную часть клеточно-проникающего пептида, что обеспечивает доставку препарата внутрь клетки. Цитотоксичность PNC-27 к раковым клеткам не зависит от р53 и обусловлена способностью связывать mHDM2, приводя к образованию трансмембранной поры и некробиозу клеток рака, не затрагивая нормальные клетки. PNC-27 изучен в экспериментах in vitro и in vivo, и показал эффективность против многих видов рака: устойчивых к химиотерапии клеточных линий рака яичников человека, лейкемии и карциномы молочной железы. PNC-27 может убивать клетки, выжившие после паклитаксела, и улучшить его противоопухолевый эффект. Наночастицы с PNC-27 могут использоваться для ранней диагностики рака. Данный пептид представляется потенциально сильным и эффективным противораковым агентом. В обзоре рассмотрены результаты доклинических испытаний PNC-27.

Белки и пептиды эффективно используются в терапии различных заболеваний, таких как рак, воспаление и некоторые аутоиммунные расстройства. Некоторые лекарственные препараты не могут достичь терапевтического эффекта, поэтому срочно необходимы эффективные подходы к доставке лекарств, повышающие их эффективность. Учеными открыт ряд коротких пептидов, которые служат векторами доставки макромолекул, называемых как клеточно-проникающие пептиды (CPP), домены транслокации белка, последовательность транслокации мембраны или «троянские пептиды» [1]. С химической точки зрения, CPP представляют собой короткие, положительно заряженные пептиды, содержащие 5–30 аминокислотных остатков, которые могут проникать через биомембрану и доставлять в клетки полезные грузы. Такая пептидная цепь содержит остатки аргинина и лизина. В последнее время CPP, как природные, так и синтетические, привлекают большое внимание благодаря своей высокой эффективности и низкой цитотоксичности in vitro и in vivo. Эти пептиды отлично подходят для быстрой доставки препаратов, стабильны в физиологических условиях и являются неиммуногенными молекулами. Кроме того, они обеспечивают неинвазивную, безопасную и эффективную доставку лекарств без нарушения клеточной структуры. Одним из примеров биологически активного пептида, содержащего фрагмент CPP, является противораковый пептид PNC-27.

Общая характеристика

PNC-27 (Pro-Pro-Leu-Ser-Gln-Glu-Thr-Phe-Ser-Asp-Leu-Trp-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Trp-Lys-Met-Arg-Arg-Asn-Gln-Phe-Trp-Val-Lys-Val-Gln-Arg-Gly, PPLSQETFSDLWKLLKKWKMRRNQFWVKVQRG; CAS 1159861-00-3)— противораковый пептид с брутто-формулой C₁₈₈H₂₉₃N₅₃O₄₄S и молекулярной массой 4031,8 Да.

Синтез пептида PNC-27 впервые осуществлен в 2001 году [2]. Вначале исследователи получили пептид из mdm-2-связывающего домена человеческого белка р53, остатки 12–26 (PPLSQETFSDLWKLL). Белок р53, играющий важнейшую роль в контроле клеточного цикла и апоптотической сигнализации, выступает основной мишенью для противораковой терапии, поскольку мутировавший р53 встречается по меньшей мере в 50% случаев рака человека [3]. Поскольку р53 катаболизируется в процессе связывания с mdm-2 (murine double minuteclone 2) с образованием комплекса, авторы разработали стратегию усиления его активности путем создания агентов, блокирующих образование этого комплекса. Чтобы обеспечить транспорт пептида через клеточную мембрану и в то же время максимально увеличить содержание активной α-спиральной конформации, к этой последовательности был присоединен фрагмент пенетратина, KKWKMRRNQFWVKVQRG, являющегося представителем CPP. Полученный пептид проявил цитотоксичность относительно культивируемых раковых клеток человека, при этом не оказывая никакого влияния на рост нормальных клеток, включая стволовые клетки, полученные из пуповинной крови человека. Пептид так же эффективно вызывал гибель раковых клеток без р53, как и в клетках с мутантным или нормальным р53. Вызванная пептидами гибель клеток не сопровождалась экспрессией апоптоз-ассоциированных белков. PNC-27 обнаруживался по крайней мере в 50% клеток в течение 15 минут после воздействия и сохранялся примерно один день. В МТТ-тесте пептид вызывал гибель >95% клеток линии карциномы молочной железы MDA-MB468, MCF-7 и MDA-MB-157 при концентрации 30–50 мкМ [4].

В 2015 году [5] для получения рекомбинантного пептида PNC27 начали применять систему на основе Escherichia coli, генетически модифицированной при помощи интеина («белковый интрон», обеспечивает распространение конкретного гена в геноме клетки). Это позволило эффективно выделять пептид однократной хроматографической очисткой.

Механизм действия 

Изначально предполагалось, что присоединение CPP будет способствовать p53-зависимой остановке клеточного цикла и апоптозу в раковых клетках [6]. Однако исследования показали, что PNC-27 индуцирует быстрый мембранолитический некроз множества различных линий раковых клеток человека. 

Кроме того, противораковый пептид PNC-27 принимает HDM-2-связывающую конформацию и убивает раковые клетки, связываясь с HDM-2 в их мембранах и вызывая мембранолиз, не затрагивая нормальные клетки [7]. Значительные количества специфического белка HDM-2 присутствуют в мембранах различных раковых клеток. В экспериментах PNC-27, но не контрольный пептид PNC-29, оказался цитотоксичным для клеток карциномы поджелудочной железы MIA-PaCa-2, вызывая 100% гибель клеток за 90 мин, а также для клеток TUC-3 и клеточной линии меланомы человека A-2058 в зависимости от дозы, но не влиял на нетрансформированные первичные фибробласты человека AG13145. 

PNC-27 вызывает некроз опухолевых клеток плохо дифференцированной линии клеток лейкемии человека без твердых тканей, а эффективность пептида зависит от экспрессии HDM-2 в плазматической мембране раковых клеток. Период полураспада PNC-27 в экспериментах in vivo составляет порядка 30 минут, но после связывания с мембранной мишенью HDM-2 время его жизни значительно увеличивается [8].

Важно отметить, что противораковый пептид PNC-27 запускает лизис опухолевых клеток, находясь в виде интактного пептида, а не его фрагментов [9]. PNC-27 вызывает селективное образование мембранных пор, что и приводит к лизису [10]. Интересной особенностью пептида является то, что его цитотоксичность зависит от температуры, достигая максимальной при 37 ºC, как показано для диапазона концентраций 100–1000 мкг/мл на различных линий раковых клеток: MIA-PaCa-2, A2058, BMRPA1 и TUC-3. Именно такая температура у человека характерна для воспалительных процессов.

Доклинические исследования in vitro

К настоящему времени проведен ряд доклинических испытаний противоракового пептида PNC-27. В качестве Одной из мишеней была выбрана лейкемия. Острый миелоидный лейкоз — это злокачественная гемопоэтическая опухоль, характеризующаяся накоплением примитивных и частично дифференцированных клональных клеток в костном мозге, периферической крови и внекостномозговых органах, например, селезенке, что приводит к нарушению нормального кроветворения. Высокие показатели рецидивов или резистентности заболевания, вероятно, обусловлены сохранением так называемых неуязвимых для лечения лейкозных стволовых клеток. 

В работе [11] показано, что PNC-27 действует не только на опухолевые клетки, не относящиеся к твердой ткани, но и на примитивную, возможно, стволовую линию клеток лейкемии человека K562. В качестве контроля использовали лейкоциты мыши. Некроз определяли по высвобождению лактатдегидрогеназы (LDH), а апоптоз — путем обнаружения каспаз 3 и 7. Авторы обнаружили, что клетки K562 сильно экспрессируют белок HDM-2 и что PNC-27 ко-локализуется с этим белком в мембранах клеток. PNC-27 избирательно цитотоксичен: 48-часовая инкубация клеток K562 с 75 мкМ PNC-27 вызывает почти 100%-ную гибель клеток с высвобождением LDH. В отличие от раковых клеток, данный пептид не оказывал никакого влияния на контрольные клетки лимфоцитов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ранние развивающиеся опухолевые клетки также экспрессируют белок HDM-2 в своих мембранах. Поскольку PNC-27 вызывает некроз лейкозных клеток K-562 и совместно с HDM-2 локализуется в мембране опухолевых клеток на ранних стадиях, ассоциация PNC-27 с HDM-2 в мембране раковой клетки приводит к образованию трансмембранных пор, которые приводит к гибели клетки. Поскольку в клетках K562 отсутствует экспрессия p53, воздействие PNC-27 на эту клеточную линию происходит по p53-независимому пути.

Несмотря на 80%-ный ответ на химиотерапию, эпителиальный рак яичников имеет самый высокий показатель летальности среди всех гинекологических злокачественных опухолей. Эффективность противоракового препарата PNC-27 показана ex vivo в лечении первичного эпителиального рака яичников [12]. От пациентов с недавно диагностированными цистаденокарциномами яичников были получены две линии клеток: одна из муцинозной цистаденокарциномы, а другая — из папиллярной серозной карциномы, OV90 и OVCAR-3. Эффект после воздействия PNC-27 отслеживался качественно с помощью световой микроскопии и количественно — путем измерения ингибирования роста клеток с помощью анализа МТТ и прямой цитотоксичности по LDH. Выяснилось, что PNC-27 ингибирует дозозависимым образом рост первичных раковых клеток и является цитотоксичным. Ингибирование линейно повышается в диапазоне 10–200 мкг/мл и затем достигает ~100% при >200 мкг/мл. Близкая картина наблюдается и для цитотоксичности. Важно подчеркнуть, что PNC-27 является цитотоксичным для клеток из устойчивых к химиотерапии клеточных линий рака яичников человека. Результаты указывают на потенциал пептида PNC-27 в качестве эффективного альтернативного лечения рака, ставшего устойчивым к существующим химиотерапевтическим препаратам.

Сравнение действия PNC-27 на мембраны HDM-2 показало, что пептид вызывает некроз в лейкозных, но не в нормальных гемопоэтических клетках [8]. Это было подтверждено для концентраций пептида 5 мкМ, 85 мкМ и 90 мкМ на клеточных линиях острого миелогенного лейкоза человека без стволовых клеток: U937, острый моноцитарный лейкоз; OCI-AML3, острый миеломоноцитарный лейкоз; и HL60, острый промиелоцитарный лейкоз. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-анализа, а прямую цитотоксичность — по высвобождению LDH и индукции апоптотических маркеров аннексина V и каспазы-3. PNC-27 вызывал некроз клеток и высвобождение LDH в течение 4 ч. Таргетинг мембранного HDM-2 может быть потенциальной стратегией лечения лейкемии. 

Пептид PNC-27 демонстрирует интересный потенциал не только как терапевтический агент, но и может найти применение в качестве диагностического средства. В работе [13] было показано, что конъюгированные наночастицы пептида Pnc-27/суперпарамагнитного оксида железа (SPIONs) могут использоваться как двойной направленный агент для ранней диагностики рака. SPIONs считаются перспективными неинвазивными инструментами визуализации в медицине. Однако они могут вызывать цитотоксическое воздействие на нормальные клетки. Авторы оценили in vitro потенциал полиэтиленимина (PEI)-SPIONs с пептидом PNC-27. Сначала PEI был конъюгирован с PNC-27 с HDM-2-связывающим доменом. Затем SPIONs были загружены в PEI-PNC-27 методом обмена лигандов. Цитотоксичность и эффективность нацеливания оценивали против клеточных линий HT-29 и CT-26, а также нормальных клеток NIH-3t3 методом МТТ и окрашивания берлинской лазурью, соответственно. Согласно результатам, способность связывания и поглощения пептида PNC-27 раковыми клетками была значительно выше, чем у клеток NIH-3t3. Однако полученные результаты свидетельствовали о более токсичном воздействии синтезированных SPIONs против линии раковых клеток CT-26 по сравнению с клетками HT-29. Кроме того, SPIONs присутствовали внутри и вокруг клеток с экспрессией HDM-2, в то время как в нормальных клетках они не проявлялись. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности наночастиц с PNC-27 для применения в диагностике рака.

Доклинические исследования in vivo

Эффективность против острого миелобластного лейкоза показана также и в экспериментах in vivo [14]. Мембранный HDM-2 (mHDM2) экспрессируется исключительно на бластах AML человека и мыши, включая субпопуляции, обогащенные лейкозными стволовыми клетками (ЛСК), но не на нормальных гемопоэтических стволовых клетках (ГСК). Повышенные уровни mHDM2 в бластах AML связаны со способностью к инициации лейкемии и химиорезистентностью. Пептид PNC-27 связывается с mHDM2, что приводит к повреждению мембраны и гибели клеток бластов AML путем некробиоза. Лечение PNC-27 in vivo привело к значительному уничтожению как «объемных» бластов AML, так и ЛСК, что было продемонстрировано, соответственно, в экспериментах по первичной и вторичной трансплантации с использованием моделей AML человека и мыши. Примечательно, что PNC-27 сохраняет нормальную активность ГСК. Авторы пришли к выводу, что воздействие на mHDM2 с помощью PNC-27 избирательно убивает клетки AML, включая ЛСК, с минимальной внецелевой гемопоэтической токсичностью

Антилейкемическую активность PNC-27 in vivo оценивали на мышах, которым привили клетки AML(2×10⁶ клеток/мышь) [14]. После подтверждения приживления и развития рака лейкемических мышей обрабатывали препаратами PNC-27, PNC-29 или инертным раствором: 2 или 3 недели по 40 мг/кг или 100 мг/кг PNC-27, PNC-29 (40 мг/кг, ежедневно) или инертный раствор. Исследователи наблюдали более длительную выживаемость у мышей, получавших PNC-27 (медиана выживаемости 54 дня), по сравнению с PNC-29 или мышами, получавшими плацебо (41 и 42 дня). Также наблюдалось значительное снижение количества CD45.2+ AML и CD45.2+ AML LSK клеток у мышей, леченных PNC-27. Вторичные реципиенты BM клеток от PNC-27-обработанных доноров показали значительно сниженную долю циркулирующих CD45.2+ клеток AML и более длительную выживаемость (43 дня против 32 дней для PNC-29 или плацебо).

Аналогичные результаты наблюдались в ксенотрансплантаты, полученные из образцов пациентов AMLчеловека [14]. Авторы пересадили мышам человеческие бласты AML и обработали их PNC-27, PNC-29 или транспортным средством после подтверждения приживления и заболевания. Наблюдалось снижение приживления AML и более длительное выживание у мышей-реципиентов, получавших PNC-27, по сравнению с PNC-29 и плацебо (медиана выживания: 136,5 против 115 против 111 дней, соответственно). Почти двукратное снижение приживления в костном мозге и селезенке также наблюдалось у мышей, обработанных PNC-27. Клетки костного мозга, собранные от мышей, обработанных PNC-27 или плацебо, затем трансплантировали вторичным реципиентам для оценки количества невосприимчивых лейкозных стволовых клеток. Снижение приживления hCD45+ клеток и более длительное выживание наблюдалось у мышей-реципиентов, получивших раковые клетки от доноров, обработанных PNC-27 (медиана выживания: 156,5 дней), по сравнению с теми, кто получил клетки от доноров, обработанных плацебо (93 дня).

В лечении гинекологических злокачественных опухолей широко используется препарат паклитаксел, который нацелен на опухолевые клетки в М-фазе клеточного цикла. Клетки в других фазах выживают после поражения и вновь заселяют опухоль. Авторы работы [15] оценили чувствительность клеток ID8 рака яичников к PNC-27 после воздействия паклитаксела и изучили потенциал синергизма между PNC-27 и паклитакселом. Для измерения цитотоксичности in vitro клетки ID8 подвергали воздействию паклитаксела в различных концентрациях в течение 12 часов. Затем среда, содержащая препарат, была удалена, и клетки культивировали в среде, содержащей различные концентрации PNC-27, в течение 24 часов. Жизнеспособность оценивали с помощью МТТ. Комбинированное лечение раз в неделю паклитакселом и PNC-27 было протестировано на внутрибрюшинной мышиной модели рака яичников (ID8). Воздействие паклитаксела приводило к неполной, зависящей от времени гибели, в то время как PNC-27 обеспечивал полную, зависящую от дозы гибель клеток ID8. Цитотоксический эффект PNC-27 зависел от его связывания с mdm-2. Блокирование mdm-2 подавляло гибель клеток под действием PNC-27. Клетки ID8, пережившие паклитаксел, демонстрировали повышенную экспрессию mdm-2 и восприимчивость к PNC-27. Для комбинации доз обнаружен синергический эффект между двумя агентами. В in vivo модели рака яичников (ID8) добавление PNC-27 к еженедельному приему паклитаксела значительно снижает рост опухоли. Таким образом PNC-27 может быть направлен на клетки, выжившие после применения паклитаксела, и улучшить его противоопухолевый эффект.

Заключение

PNC-27 — это новый синтетический противораковый пептид, нацеленный для воздействия на мембранный белок mHDM2. Пептид содержит два важных фрагмента: HDM-2-связывающий домен, соответствующий остаткам 12–26 р53, и клеточно-проникающий домен. Цитотоксичность PNC-27 не зависит от р53 и уникальным образом обусловлена его способностью связывать mHDM2. Связывание с PNC-27 приводит к образованию трансмембранной поры и гибели клеток путем некробиоза.

Результаты доклинических экспериментов позволяют предположить, что эта особенность придает пептиду способность убивать клетки множество видов рака, практически не повреждая нормальные клетки. Таким образом, этот пептид представляется потенциально сильным и эффективным противораковым агентом в лечении рака человека.

Важной особенностью PNC-27 является цитотоксичность для клеток карциномы молочной железы и устойчивых к химиотерапии клеточных линий рака яичников человека. Атака мембранного HDM-2 может стать потенциальной стратегией лечения лейкемии с минимальной внецелевой гемопоэтической токсичностью. Кроме того, PNC-27 может убивать клетки, выжившие после применения паклитаксела, и улучшить его противоопухолевый эффект. Наночастицы с PNC-27 могут найти применение для ранней диагностики рака. Пептид PNC-27 выглядит как перспективный противораковый агент и нуждается в проведении развернутых исследований in vivo с выходом на клинические испытания.

1.         Kotadiya, D.D., Patel, P., Patel, D.H., Cell-Penetrating Peptides: A Powerful Tool for Targeted Drug Delivery.Current Drug Delivery, 2023. 20: p. 1-21. DOI: http://dx.doi.org/10.2174/1567201820666230407092924.

2.         Kanovsky, M., Raffo, A., Drew, L., Rosal, R., Do, T., Friedman, F.K., Rubinstein, P., Visser, J., Robinson, R., Brandt-Rauf, P.W., Peptides from the amino terminal mdm-2-binding domain of p53, designed from conformational analysis, are selectively cytotoxic to transformed cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001. 98(22): p. 12438-12443.

3.         Prives, C., Hall, P.A., The p53 pathway. The Journal of pathology, 1999. 187(1): p. 112-126.

4.         Do, T.N., Rosal, R.V., Drew, L., Raffo, A.J., Michl, J., Pincus, M.R., Friedman, F.K., Petrylak, D.P., Cassai, N., Szmulewicz, J., Preferential induction of necrosis in human breast cancer cells by a p53 peptide derived from the MDM2 binding site. Oncogene, 2003. 22(10): p. 1431-1444.

5.         Rodríguez, V., Lascani, J., Asenjo, J.A., Andrews, B.A., Production of cell-penetrating peptides in Escherichia coli using an intein-mediated system. Applied biochemistry and biotechnology, 2015. 175: p. 3025-3037.

6.         Rosal, R., Pincus, M.R., Brandt-Rauf, P.W., Fine, R.L., Michl, J., Wang, H., NMR solution structure of a peptide from the mdm-2 binding domain of the p53 protein that is selectively cytotoxic to cancer cells. Biochemistry, 2004. 43(7): p. 1854-1861.

7.         Sarafraz-Yazdi, E., Bowne, W.B., Adler, V., Sookraj, K.A., Wu, V., Shteyler, V., Patel, H., Oxbury, W., Brandt-Rauf, P., Zenilman, M.E., Anticancer peptide PNC-27 adopts an HDM-2-binding conformation and kills cancer cells by binding to HDM-2 in their membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010. 107(5): p. 1918-1923.

8.         Thadi, A., Lewis, L., Goldstein, E., Aggarwal, A., Khalili, M., Steele, L., Polyak, B., Seydafkan, S., Bluth, M.H., Ward, K.A., Targeting membrane hdm-2 by pnc-27 induces necrosis in leukemia cells but not in normal hematopoietic cells. Anticancer Research, 2020. 40(9): p. 4857-4867.

9.         Sookraj, K.A., Bowne, W.B., Adler, V., Sarafraz-Yazdi, E., Michl, J., Pincus, M.R., The anti-cancer peptide, PNC-27, induces tumor cell lysis as the intact peptide. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2010. 66(2): p. 325-331. DOI: 10.1007/s00280-009-1166-7.

10.       Sarafraz-Yazdi, E., Mumin, S., Cheung, D., Fridman, D., Lin, B., Wong, L., Rosal, R., Rudolph, R., Frenkel, M., Thadi, A., PNC-27, a Chimeric p53-Penetratin Peptide Binds to HDM-2 in a p53 Peptide-like Structure, Induces Selective Membrane-Pore Formation and Leads to Cancer Cell Lysis. Biomedicines, 2022. 10(5): p. 945.

11.       Davitt, K., Babcock, B.D., Fenelus, M., Poon, C.K., Sarkar, A., Trivigno, V., Zolkind, P.A., Matthew, S.M., Grin’kina, N., Orynbayeva, Z., The anti-cancer peptide, PNC-27, induces tumor cell necrosis of a poorly differentiated non-solid tissue human leukemia cell line that depends on expression of HDM-2 in the plasma membrane of these cells. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2014. 44(3): p. 241-248.

12.       Sarafraz-Yazdi, E., Gorelick, C., Wagreich, A.R., Salame, G., Angert, M., Gartman, C.H., Gupta, V., Bowne, W.B., Lee, Y.-C., Abulafia, O., Ex vivo efficacy of anti-cancer drug PNC-27 in the treatment of patient-derived epithelial ovarian cancer. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2015. 45(6): p. 650-658.

13.       Rahmani, R., Darroudi, M., Gharanfoli, M., Chamani, J., Gholamin, M., Hashemi, M., Conjugated Pnc-27 Peptide/Pei-Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles (Spions) as a Double Targeting Agent for Early Cancer Diagnosis. JDDST-D-22-00006, 2022.

14.       Wang, H., Zhao, D., Nguyen, L.X., Wu, H., Li, L., Dong, D., Troadec, E., Zhu, Y., Hoang, D.H., Stein, A.S., Targeting cell membrane HDM2: A novel therapeutic approach for acute myeloid leukemia. Leukemia, 2020. 34(1): p. 75-86.

15.       Alagkiozidis, I., Gorelick, C., Shah, T., Chen, Y.-J.A., Gupta, V., Stefanov, D., Amarnani, A., Lee, Y.-C., Abulafia, O., Sarafraz-Yazdi, E., Michl, J., Synergy between Paclitaxel and Anti-Cancer Peptide PNC-27 in the Treatment of Ovarian Cancer. Annals of clinical and laboratory science, 2017. 47(3): p. 271-281.