Обзор потенциального лекарства от COVID – пептидов эзрина человека: идеальное сочетание противовоспалительной и противовирусной иммунной активности

Пептид-1 эзрина человека (HEP1, торговое название Гепон) и RepG3 (производное HEP1) успешно использовались в качестве ингаляционного раствора в форме спрея для терапии добровольцев с COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести. Такой подход основан на более раннем успешном лечении с помощью HEP1 острого респираторного вирусного заболевания с воспалительными осложнениями. Пептиды эзрина являются ингибиторами экспрессии IL-6 и других воспалительных цитокинов и, по-видимому, корректируют нарушение регуляции врожденного иммунного ответа на SARS-CoV-2. Они также являются адъювантами адаптивного иммунитета В-клеток и увеличивают титры антител у мышей, что обеспечивает защиту от летальной вирусной инфекции. Предварительные, но многообещающие результаты с пептидами эзрина требуют подтверждения в крупных рандомизированных плацебо-контролируемых клинических исследованиях.

Обзор является адаптацией препринта статьи Holms, R., Ataullakhanov, R., «Review of a potential cure for COVID with Human Ezrin Peptides: An Ideal Combination of Anti-Inflammatory and Anti-Viral Immune Activity». Март, 2021.

Лечение COVID-19 и профилактика повторной инфекции SARS-CoV-2

В настоящее время существует потребность в безопасном, эффективном, дешевом и надежном лечении COVID-19. Хорошо известно, что высокие уровни экспрессии провоспалительного интерлейкина IL-6 в ответ на инфекцию SARS-CoV-2 являются признаком тяжелой формы COVID-19 и высокого риска смерти [1]. Лечение моноклональными антителами против IL-6 не оказалось надежным. Идеальная терапия должна исправлять дисфункцию врожденного иммунного ответа на SARS-CoV-2, который приводит к чрезмерному воспалению, а также усиливать адаптивный ответ для устранения инфекции и предотвращения повторного инфицирования. Пептиды эзрина могут способствовать достижению этих клинических конечных точек.

Пептиды эзрина человека

Эзрин и его гомологи радиксин и моэзин (представители семейства ERM) являются белками, ассоциированными с клеточной мембраной, с множеством сайтов связывания к рецепторам клеточной поверхности, внутриклеточным киназам и актину, образующих белковые комплексы, участвующие в передаче сигналов, форме и подвижности клеток. Синтетический пептид Human Ezrin Peptide One (HEP1, Gepon, Hepon, Гепон; TEKKRRETVEREKE) является активным фармацевтическим ингредиентом препарата «Гепон», зарегистрированного в Российской Федерации как иммуномодулятор для местного и внутреннего применения для восстановления эффективного иммунитета в лечение и профилактике вирусных, бактериальных и грибковых инфекций. Гепон (Р N000015/03) производится компанией ООО «Иммафарма». Пептиды эзрина клинически используются в России более двадцати лет и имеют отличные показатели безопасности. HEP1 имитирует часть структуры Hep-рецептора в центральном альфа-домене эзрина человека. Биологическая активность гепона исследуется в РФ с 2001 года. За предыдущие восемнадцать лет в Москве были проведены три успешных клинических испытания с использованием HEP1 для лечения острой вирусной респираторной инфекции (AVRI) с осложнениями, включая пневмонию, и было достигнуто уменьшение воспаления и снижение уровня IL-6  [2].

Пептиды эзрина обладают иммуноамплификационными и противовоспалительными свойствами. Они эффективны против широкого спектра вирусов (ВИЧ, ВГС, ВПЧ, герпес 1 и 2, а также респираторные вирусы, вызывающие острую вирусную респираторную инфекцию AVRI). Пептиды эзрина действенны при лечении инфекций и воспалений, связанных с кандидозом и другими грибковыми поражениями слизистых оболочек. Противовоспалительные свойства и способность пептидов эзрина стимулировать фибробласты и регенерацию тканей применялись для лечения язв кишечника, полости рта, желудка и двенадцатиперстной кишки, лучевых и трофических язв кожи.

HEP1 является усилителем иммунного ответа благодаря активации B-клеток или антигенпрезентирующих клеток (увеличение титров антител в 2–3 раза), при этом значительно подавляя экспрессию воспалительных цитокинов, особенно IL-6, IL-1β, IL-8 и TNFα. Регуляторный пептид эзрина RepG3 представляет собой синтетический пептид из 14 аминокислот, 11 из которых идентичны гепону, но три концевых заменены глицином. Такая модификация удваивает противовоспалительную активность RepG3 по сравнению с гепоном в модели воспаления у мышей, вызванного декстрансульфатом.

Пептиды эзрина подавляют воспаление и усиливают ответ В-клеток, что является идеальной комбинацией характеристик для лечения COVID-19. В 2020 году гепон и RepG3 использовались для устранения симптомов добровольцами с COVID-19 от легкой до умеренной степени. Пациенты, получавшие терапию пептидами эзрина, переходили от SARS-CoV-2-положительному ПЦР к отрицательному в течение 5–7 дней. Эзрин также регулирует взаимодействие шип-белка SARS с клетками, сдерживает слияние и проникновение вируса.

Эзрин и В-клеточный рецептор (BCR)

Эзрин и его гомологи радиксин и моэзин регулируют иммунный ответ B-клеток, а также имеют решающее значение для поляризации, миграции и межклеточной адгезии лейкоцитов. После взаимодействия B-клеточного рецептора (BCR) с антигеном, B-клетки вносят вклад в адаптивный иммунный ответ на вирусную инфекцию, трансформируясь в продуцирующие антитела плазматические клетки и клетки длительной иммунологической памяти. Эзрин непосредственно участвует в реакции и трансмембранной передаче сигналов в В-клетках и их активации антигенами.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Лечение эзрин-пептидом добровольцев с COVID-19

Ранние симптомы COVID-19 через 7 дней после заражения обычно включают густую слизь и боль в горле, сухой кашель, головную боль, умеренную лихорадку (37–38 ⁰C) и потерю обоняния. Более двадцати добровольцев с COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести использовали растворы пептидов эзрина (HEP1 или RepG3) с концентрацией 1 мг/мл, которые применялись либо в виде спрея с ингаляционным раствором (>10 добровольцев), либо раствора HEP1 для подкожного введения (>10 добровольцев). Все группы показали быстрое уменьшение лихорадки и других связанных с COVID-19 симптомов, и стали отрицательными по ПЦР на SARS-CoV-2 через 5–10 дней от начала лечения (о неудачах или побочных реакциях не сообщалось).

Лечение ингаляционным спреем раствора HEP1

Семья из четыре человек (взрослые 68 и 35 лет, дети 4 и 1,5 года) с симптомами COVID-19 и положительным результатом ПЦР на SARS-CoV-2 у женщины в двух отдельных тестах получали лечение спреем для ингаляции 2 мг/ 2 мл HEP1 три раза в день в течение пяти дней. Все больные восстановились в течении семи дней. Женщина подтвердила отрицательный результат ПЦР на SARS-CoV-2 и IgM 0,6 (контроль <2), IgG 57 (контроль <10) ЕД/мл.

Лечение подкожным введением HEP1

Мужчина, 69 лет, с симптомами COVID-19 и положительным результатом ПЦР на SARS-CoV-2 получал лечение подкожным введением 0,2 мг HEP1 в 1 мл физиологического раствора раз в сутки. Через два дня наступило значительное улучшение, через пять – симптомы COVID исчезли, пациент был здоров, через шесть – тест ПЦР на SARS-CoV-2 оказался отрицательным

Лечение ингаляционным спреем с раствором RepG3

Добровольцы с COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести самостоятельно вводили в виде спрея в горло и вдыхали водный раствор RepG3 (2 мг в 2 мл воды) три раза в день в течение пяти дней. Два человека с подтвержденным методом ПЦР SARS-CoV-2 и симптомами COVID-19 (лихорадка 10 дней, низкий уровень насыщения кислородом) получали лечение спреем для горла RepG3 2 мг/2 мл три раза в день. Всего через час после первой процедуры температура тела одного пациента снизилась с 39 °C до 37,3 °C, через 12 часов лихорадка исчезла, а температура тела вернулась к норме 36,6 °C. Другой прошел такое же быстрое выздоровление. У ребенка пациентов также появились симптомы COVID, которые были оперативно купированы с помощью RepG3.

Общие выводы о добровольцах с COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести

Эффект от лечения пептидами эзрина заключается в быстром снижении температуры, головной боли и боли в горле, временном увеличении лимфатических узлов (не более нескольких часов), устранении кашля и разжижении густой слизи. Снижение симптомов до нуля в течение периода лечения и переход от положительного к SARS-CoV-2-отрицательному ПЦР обычно достигается в течение семи дней.

Противовоспалительный эффект пептидов эзрина

Противовоспалительная активность HEP1 и RepG3 сравнивалась in vivo на модели воспаления кишечника с использованием раствора декстрансульфата (DSS), которое имитирует воспалительное заболевание кишечника (IBD) – колит. В этой модели было показано, что RepG3 в два раза эффективнее подавляет экспрессию IL-6, чем гепон, в экспериментах, проведенных д-р М. Чулкиной [3]. В стимулированных с целью продуцирования воспалительных цитокинов лейкоцитах периферической крови человека пептид Rupe312 ингибирует экспрессию провоспалительных IL-6, IL-1β, IL-8 и TNFα.

HEP1 усиливает образование антител

Синтетические пептиды, имитирующие рецептор Hep в альфа-домене человеческого белка эзрина, усиливают образование антител. Повышение выработки антител коррелирует с защитой от летальных инфекций на животных моделях. Было продемонстрировано, что на лабораторных мышах HEP1 и другие пептиды эзрина усиливают образование антител, интенсивность иммунных реакций и Т-клеточный ответ как на растворимые гетерологичные антигены (яичный альбумин (EA), 50 мкг в 0,2 мл физиологического раствора внутрибрюшинно), так и на клеточные гетерологичные антигены (эритроциты овцы (SE), 2 или 20 млн. SE-клеток в 0,5 мл физиологического раствора внутрибрюшинно). HEP1 и другие пептиды эзрина (HP1-5: TEKKR, HP1-9: TEKKRRETV, HP1-11: TEKKRRETVER, HP3-12: KKRRETVERE, HP4-14: KRRETVEREKE, HP6-14: RETVEREKE, HP10-14: EREKE) растворяли в физиологическом растворе с серийным десятикратным разведением в диапазоне доз от 10 нг до 10 мкг на мышь и вводили за 60 минут или непосредственно перед внутрибрюшинной инъекцией EA или клеток SE. Иммуноадъювантные свойства (т. е., способность усиливать иммунный ответ на основной компонент) родственных пептидов сравнивали с известными препаратами: полный адъювант Фрейнда либо полиоксидоний. Через четыре дня после иммунизации интенсивность иммунного ответа на инъекцию SE определяли по накоплению в селезенке мышей антителообразующих клеток (ab-клеток), секретирующих SE-специфические антитела IgM. Сывороточный иммунный ответ оценивали с помощью анализа гемагглютинации и гемолиза.

У мышей, получавших перорально HEP1 в течение 20 дней до иммунизации, после вторичной бустерной иммунизации клетками SE титры сывороточных гемагглютининов были в два раза выше, а титры сывороточного гемолизина – в 3 раза выше, чем в контрольной группе из 27 мышей, которым вводили только воду (плацебо-контроль). Иммуноадъювантное действие также наблюдалось при внутрибрюшинном введении HEP1 в диапазоне доз от 10 нг до 10 мкг на мышь, с оптимальной дозой 0,1–1 мкг HEP1. Безопасность HEP1 позволяет применять длительное ежедневное пероральное дозирование 10 мг HEP1 для коррекции хронической иммунной дисфункции у людей (0,1 мг/кг).

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ НА МЫШАХ И ЧЕЛОВЕКЕ

HEP1, растворенный в 0,2 мл физиологического раствора, был эффективен в качестве адъюванта, вводимого внутрибрюшинно в диапазоне доз от 10 нг до 10 мкг на мышь, либо за 60 минут до инъекции растворимого антигена EA, либо одновременно с иммунизацией клеточным антигеном SE. Кроме того, HEP1 также оказался эффективным адъювантом при пероральном введении в суточной дозе 0,5 мг HEP1 в 0,2 мл воды на мышь (25 мг/кг) в течение 20 дней до иммунизации. По сравнению с контрольными мышами, адъювантная активность HEP1 вызвала образование в 2,5 раза больше плазматических клеток, секретирующих IgM (дифференцированные зрелые В-клетки) в селезенке, в два раза больше антигенспецифических агглютининов и в три раза – антигенспецифических гемолизинов в периферической крови обработанных мышей. Первичная и бустерная иммунизация смесью HEP1 с растворимым антигеном приводила к увеличению в 2–7 раз антиген-специфических антител IgG во время вторичного иммунного ответа после бустерной антиген-вакцины.

Адъювантный эффект на первичную продукцию антител IgM к клеточному антигену

Через четыре дня после внутрибрюшинной инъекции 5млн. клеток SE в селезенке мышей накопилось в среднем 600±75 антителообразующих клеток, секретирующих SE-специфические антитела IgM, по сравнению с 50 у необработанных контрольных мышей. Напротив, в селезенке мышей, которым инъецировали 0,1 мкг HEP1 за час до инъекции клеток SE, в среднем было 1500±200 антителообразующих B-клеток, секретирующих SE-специфические IgM.

Адъювантный эффект перорального HEP1 на иммунизацию и бустер SE

Группа из 27 мышей перорально получила двадцатидневный курс раствора HEP1 0,5 мг/0,2 мл до иммунизации эритроцитами овцы и бустерной иммунизации SE. Контрольной группе вводили плацебо. По завершению курса была проведена иммунизация 20 млн. SE-клеток с последующей бустерной дозой 20 млн. Уровни сывороточного гемагглютинина и гемолизина, обусловленные IgM в периферической крови, измеряли с недельными интервалами. Иммунный ответ на чужеродный клеточный антиген привел к усилению продукции антител IgM у мышей, которым перорально вводили HEP1, по сравнению с контрольными, которые не получали HEP1. Эффект адъюванта был четко виден во время вторичного иммунного ответа на бустер SE-клеток. Титр гемагглютинина и гемолизина достигал ~1250–2000 на 35-ый день после применения HEP1 и введения бустера.

Адъювантное действие пептидов эзрина при введении эритроцитов овцы

У мышей внутрибрюшинная инъекция HEP1 (от 0,01 до 10 мкг на мышь) за час до иммунизации гетерологичными эритроцитами является эффективным адъювантом, который может усиливать первичный синтез IgM к антигенам. HEP1 до или во время воздействия антигенов в среднем увеличивала количество антиген-специфических клеток, продуцирующих антитела, в селезенке в 2,5 раза. У мышей пероральное введение раствора HEP1, 0,5 мг/0,2 мл в день курсом в течение двадцати дней до воздействия чужеродных антигенов, увеличивало Т-зависимый ответ антител.

Иммуноадъювантный эффект гомологов HEP1

Иммуноадъювантные свойства пептидных фрагментов эзрина сравнили с HEP1 при внутрибрюшинной иммунизации мышей 5 млн. клеток SE. Введение HEP1 или специфических фрагментов (от 10 нг до 10 мкг на мышь) пептида эзрина мышам за час до иммунизации привело через четыре дня к значительному усилению иммунных ответов на чужеродные антигены. В среднем в селезенках мышей накапливалось 600 клеток, продуцирующих антитела IgM, специфичных для SE. Как правило, фрагменты пептида HEP1 и эзрина увеличивали количество ab-клеток в 2–3 раза, но картина доза–ответ варьировалась.

HEP1 является эффективным адъювантом у мышей, который через семь дней может усиливать вторичный синтез антител IgG к растворимым гетерологичным антигенам. Инъекция 50 мкг HEP1 одновременно с водорастворимым яичным альбумином приводила к увеличению титра антител IgG в среднем в 5–10 раз при вторичном иммунном ответе после бустерной иммунизации. Два отдельных эксперимента подтвердили сложный дозозависимый ответ на адъювант HEP1. Пиковый титр IgG (2300) соответствовал дозе 0,01 мкг, снижался при 0,1 мкг и снова увеличивался при 1 мкг, но не уже достигал максимума.

Было обнаружено, что все протестированные синтетические фрагменты HEP1 длиной 5–12 аминокислот обладают связанной иммунноадъювантной активностью, что позволяет предположить их действие на стабильность Hep-рецептора, и что адъювантная активность может возникать из-за конформационного изменения эзрина. HP10-14 несколько превзошел HEP1 по эффективности. Предположительно, активны три различных области синтетического пептида HEP1: по пять N-концевых и C-концевых аминокислот и десять серединных.

Иммунная защита с помощью пептидов эзрина от герпетической инфекции у мышей.

В России разработана экспериментальная модель летальной герпес-вирусной инфекции мышей для проверки эффективности молекул иммуностимуляторов. В этой модели мыши гибнут в течение 48 часов после введения HSV-1.

Три пептида – HEP1, Rupe20-32 и Rupe10-24 – были протестированы на адъювантную активность в трех различных концентрациях (1, 10 или 100 нг на мышь) в модели инфекции, вызванной летальным вирусом герпеса. Каждая из девяти групп состояла из 20 лабораторных белых мышей, которым внутрибрюшинно вводили растворы пептидов за 48 часов, а затем за 24 часа до смертельной внутрибрюшинной инъекции вируса герпеса (штамм L2 HSV-1) с титром 1000 LD₅₀ в 0,2 мл среды (титр 3,5Log/0,2 мл). Отрицательный контроль не получал адъюванта перед инъекцией вируса. Положительный контроль – ридостин (100 мкг на мышь) за 48 часов и 24 часа до заражения.

За мышами наблюдали 14 дней. Необработанные мыши контрольной группы, инфицированные HSV-1, умерли через 1,25 дня. Группа, получавшая предварительно ридостин, прожила 6 дней. Мыши, которым вводили пептиды, жили 5,4–10,1 дней. Было обнаружено, что 0,1 мкг (100 нг) пептида эзрина на мышь более эффективно, чем 100 мкг (100000 нг) ридостина на мышь. Следовательно, эти препараты предоставляют в тысячу раз более мощную защиту животных от герпеса HSV-1. Все пептиды эзрина показали защитный эффект в диапазоне доз 1–100 нг на мышь.

Эффект эзрин-пептидного адъюванта при вакцинации Kombiotech (KHBV) против гепатита B в клинических испытаниях на людях.

Как правило, пациенты, завершившие курс вакцинации, считаются невосприимчивыми к гепатиту B (HBV), если их титр анти-HBs (поверхностных антител к гепатиту B) превышает 10 мМЕ/мл (миллимеждународных единиц на миллилитр). В исследовании вакцинации против гепатита B у 185 детей со злокачественными опухолями с использованием вакцины Kombiotech (KHBV) для профилактики инфекции гепатита B с различными адъювантами или без них была случайным образом выбрана подгруппа из 15 человек для введения KHBV в сочетании с пероральным адъювантом HEP1 (Группа HEP1). Контрольная группа из 16 детей получила вакцину KHBV без адъюванта. Курс вакцинации KHBV представлял собой серию из трех инъекций с интервалом в месяц, за которыми следовала четвертая инъекция через шесть месяцев от первого введения. В группе HEP1 применяли 2 мг/2 мл раствора HEP1 сублингвально, держа в течение двух минут во рту, а затем проглатывая перед каждой из четырех инъекций KHBV.

В контрольной группе у 14 из 16 детей (87%) произошла сероконверсия со средним титром 90,4 мМЕ/мл. В группе HEP1 у 13 из 15 детей (87%) также наблюдалась сероконверсия, но с удвоенным средним титром 181,1 мМЕ/мл. HEP1 увеличил процент пациентов, ответивших в диапазоне 100–1000 мМЕ/мл, в два раза и более 1000 мМЕ/мл –в четыре раза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Текущая гипотеза о механизме действия пептидов эзрина заключается в том, что они действуют на конформацию рецептора человеческого эзрина на внешней поверхности клеточной мембраны лимфоцитов, эпителиальных клеток, фибробластов, моноцитов и макрофагов. Считается, что высокозаряженные пептиды эзрина быстро взаимодействуют с заряженной структурой, вызывая аллостерический эффект, который способствует открытию субмембранно-активной формы эзрина. Активная конформация эзрина создает сигнальные комплексы клеток и усиливает последующие сигнальные каскады. В B-лимфоцитах активированный эзрин образует комплексы с рецептором B-клеток и сигнальными белками, усиливая активацию B-клеток и усиливая продукцию антител, стимулируя иммунную реакцию.

Механизм подавления пептидом эзрина экспрессии IL-6 и других воспалительных цитокинов все еще остается предположительным. Гепон и родственные препараты могут оказаться полезными в лечении COVID-19.

1.             Aziz, M., Fatima, R., Assaly, R., Elevated interleukin-6 and severe COVID-19: A meta-analysis. Journal of Medical Virology, 2020. 92(11): p. 2283-2285. DOI: https://doi.org/10.1002/jmv.25948.

2.             Safonova O.A., Pichukin A. B., Kozhemyakina E. Sh., Malshev N. A., and Ataullakhanov R. I., “Treatment of Acute Respiratory Disease and its Complications (Pneumonia)” published in Chapter 7, “Immunotherapy of Respiratory Disease”, Section 2 “Immunotherapy of Diseases of the Respiratory Tract, in the book “Immunotherapia”, p122-158, Editors: Khaitov R.M., and Ataullakhanov R.I., (2011) published by Izdatekskaya Group, GEOTAR-Media.

3.             Chulkina, M.M., Pichugin, A.V., Ataullakhanov, R.I., Pharmaceutical grade synthetic peptide Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu ameliorates DSS-induced murine colitis by reducing the number and pro-inflammatory activity of colon tissue-infiltrating Ly6G+ granulocytes and Ly6C+ monocytes. Peptides, 2020. 132: p. 170364. DOI: https://doi.org/10.1016/j.peptides.2020.170364.