Шишковидное тело (эпифиз, pineal gland) является важной эндокринной железой, находящейся у подавляющей части позвоночных в головном мозге. Шишковидная железа вырабатывает множество регуляторных соединений, включая нейромедиатор мелатонин, отвечающий за сон и продолжительность отдельных его фаз, а также воздействующий на сезонные и циркадные циклы [1] и обладающий антиоксидантным действие и стимулирующим – по отношению к иммунитету [2]. Неудивительно, что эпифиз и секретируемые им вещества давно привлекают внимание исследователей как потенциальные лекарственные препараты. Достаточно давно было показано, что некоторые неочищенные пептидные экстракты или очищенные пептиды, выделенные из шишковидной железы, обладают антигонадотропной, метаболической и противоопухолевой активностью [3]. В 1955 году сообщалось о продлении срока жизни крыс при введении экстракта шишковидного тела; в начале 1970-ых были опубликованы первые доказательства того, что применение низкомолекулярного пептидного экстракта из эпифиза (коммерческая форма названа позже «Эпиталамин») вызывало нормализацию цикла эструса пожилых крыс (самок), а также уменьшение восприимчивости гипоталамо-гипофизарного комплекса к ингибированию обратной связи к эстрогенам [3, 4]. Позже была показана высокая биологическая активность эпиталамина. Длительное лечение препаратом продлевает продолжительность жизни животных, замедляет старение репродуктивной системы, улучшает показатели иммунных функций и тормозит развитие спонтанных, вызванных некоторыми химическими агентами или рентгеновскими лучами, и трансплантированных опухолей [3].

Технология получения

Физиологически активные вещества получали из бычьей шишковидной железы, собираемой на заводе «Ленмясокомбинат». Основные этапы подготовки были следующими: нативные ткани замораживали в ацетоне в течение 48 часов, сливали растворитель, ткани гомогенизировали и проводили экстракцию в 3% уксусной кислоте в присутствии ZnCl₂ в течение 72 часов [3]. После центрифугирования к супернатанту при охлаждении добавляли ацетон, образовавшийся осадок промывали ацетоном и эфиром на фильтре до образования белого порошка, который стерилизовали и подвергали лиофильной сушке. Полученный продукт представлял собой смесь полипептидов, фракции с молекулярными массами 250, 11000 и 1200 Да находились в соотношении 74:16:10, соответственно. Биологические испытания на мышах показали, что антигонадотропный эффект низкомолекулярной фракции был выше, чем высокомолекулярной фракции [3]. Фармацевтический комитет разрешил использовать в коммерческих целях лекарственную форму пептидного препарата шишковидной железы в 1990 году [5]. Препарат используют внутримышечно по 5–10 мг в день курсами до 10 дней для лечения климактерических миокардиопатий. В целом, эпиталамин проявляет свойства эффективного регулятора нейроэндокринной системы организма [6, 7].

Выделение веществ из природных источников было и остается необходимостью при получении и исследовании пептидов. Однако выделение пептидов часто проблематично, так как, зачастую, концентрация таких медиаторов колеблется от 10^-15 до 10^-12 моль/мг свежего веса ткани, а способы выделения обычно страдают от недостатков, например, ограниченной доступности источников, сложностями логистики при сборе или хранении соответствующих органов, например поджелудочной железы свиньи или быка для производства инсулина [8]. Возможное загрязнение ткани, используемой для выделения терапевтических пептидов и белков патогенными вирусами, представляет огромную опасность для здоровья. В настоящее время многие терапевтические пептиды и белки получают рекомбинантными методами или синтетически. Следовательно, разработка процессов синтеза чистых пептидных препаратов является высокоприоритетной задачей.

Метод экстракции с использованием этанолсодержащей соляной кислоты был впервые применен для выделения инсулина из ткани поджелудочной железы [8]. В случае относительно термостабильных пептидов, протеолитические ферменты в ткани могут быть инактивированы кратковременным кипячением и последующей экстракцией холодной 0,2 М HCl. Выделение гастрина и секретина по этому способу было описано в начале 1960-х годов. Среди пептидов, получаемых экстракцией и одобренных в качестве фармацевтических препаратов, находятся глюкагон, секретин, циклоспорин [8]. Препаративное выделение физиологически активных соединений из эпифиза путем экстракции, необходимое для получения фармакологически приемлемых композиций, было детально изучено и запатентовано российскими учеными [9-11]. Так, в патенте [9] описан метод экстракции, начиная от измельчения и гомогенизации, а также очистки конечного продукта. Гомогенизацию и последующую экстракцию проводят с помощью физраствора (pH=4,8–5,0), а очистку – методом гельхроматографии. Для получения пептидов с антигонадотропным эффектом [10] эпифиз крупного рогатого скота экстрагируют раствором уксусной кислоты, и после цикла заморозки/разморозки с осветлением, очищают ультрафильтрацией на мембранах, получая пептидную фракцию до 10 кДа (для сравнения, в эпиталамине фракция может содержать пептиды массой до ~60 кДа).

Состав

Необходимо учитывать широкий спектр пептидных соединений, содержащихся в эпифизе. В работе [12] был тщательно изучен протеом шишковидного тела. Авторами в экстракте шишковидной железы человека, с помощью метода жидкостной хроматографии, совмещенного с масс-спектрометрией высокого разрешения (LC-MS/MS), в 61 отдельной пептидной фракции было идентифицировано 5874 белка. Из них, 5820 белков были обнаружены впервые (на 2016 год), причем 1136 белков содержат сигнальный пептидный домен, что указывает на активную природу этих белков. Кроме того, анализ данных масс-спектрометрии для ацетилированных пептидов N-конца белка позволил идентифицировать 1023 таких пептидов. Среди них – белки и пептиды шишковидной железы, связанные с метаболизмом глутамата, белки с секреторным потенциалом, с известными эндокринными функциями, белки «биологических часов», необходимые для регуляции циркадного поведения. Очевидно, что эти значения не окончательные, и при использовании больших количеств ткани и более чувствительных методов могут быть обнаружены дополнительные белки и пептиды.

Полипептидный комплекс эпифиза (ПЭ) преимущественно представляет собой смесь пептидов с молекулярной массой до 10 кДа. Анализ аминокислотного состава показал, что наиболее часто выявляются глутаминовая кислота (Glu), аспарагиновая кислота (Asp), аланин (Ala) и глицин (Gly). С помощью LC-MS были обнаружены свободные аминокислоты (3,26%), дипептиды (23,19%), трипептиды (50,72%), тетрапептиды (22,10%) и пентапептиды (0,72%) [13]. Всего в экстракте было идентифицировано 341 органических компонентов. Среди выявленных коротких пептидов и свободных аминокислот 87% молекул являлись L-изомерами аминокислотных остатков и 17% – модифицированными аминокислотными остатками (амидирование, окисление и лактамизация). Среди тетрапептидов полипептидного комплекса эпифиза был обнаружен пептид AEDG, проявляющий биологические эффекты, сходные с таковыми у смеси, но в более низких концентрациях.

Основываясь на этом, исследователи предположили, что биологические эффекты полипептидного комплекса эпифиза определяются действием компонента AEDG. Интересно, что еще в 2001 году было запатентовано изобретение [11], где, на основании анализа аминокислотного состава были синтезированы тетрапептиды AEDP и AEDG. Последний известен под названием эпиталон. Разработка препарата была проведена научным коллективом чл.-корр. РАН Хавинсона В. Х. (Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН [14].

Исследования

В совместном исследовании российских ученых и сотрудников Института геронтологии Национальной академии медицинских наук Украины провели серию клинических испытаний геропротекторного эффекта пептидов-биорегуляторов вилочковой (тималин) и шишковидной (эпиталамин) желез на 266 пожилых пациентах [15]. Основную группу составили 94 пациента женского пола, возраст которых находился в диапазоне 66–94 лет. Отбор женщин объяснялся их преобладанием среди лиц старше 60, а также особенностями женской эндокринной системы. Биорегуляторы применялись в первые 2–3 года эксперимента. Группа 1 (контроль) получала плацебо, в группе 2 применялся тималин, в группе 3 – эпиталамин, в группе 4 – комплекс из двух препаратов. Во всех случаях введение осуществляли внутримышечно по 10 мг/день на протяжении 10 дней (по 100 мг на курс). Биорегуляторы применялись в сочетании со стандартной терапией по имевшимся показаниям. Повторно пациенты были обследованы спустя 10 дней после завершения терапии и через 4 месяца. Терапию эпиталамином и тималином снова провели через год. Следовательно, пациенты прошли два этапа лечения за два года. Еще одну группу составили 20 разнополых пациентов, которым назначили эпиталамин+тималин одновременно, дозировка каждого 10 мг, по 10 дней каждый год на протяжении шести лет. Другие испытания включали 152 пациента, находившихся под постоянным амбулаторным наблюдением. В группу, в основном, включили пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС). Наряду с перечисленными, сформировали группу из 68 пациентов с ускоренным старением. Всех участников распределили в 3 выборки, получавшие плацебо, эпиталамин или тималин. Каждый агент внутримышечно инъецировали пятью последовательными дозами по 10 мг/день каждые 2–3 дня (50 мг на курс). Перерыв между назначениями не превышал полгода. Всего, пациенты прошли шесть курсов биорегуляции. Эффекты пептидных препаратов определяли исходя из изменения самочувствия пациентов, функционирования желез внутренней секреции, иммунитета, умственного и физического состояния, изменений ткани костей, печени, содержания липидов в крови, переносимости углеводов и кислородного обмена.

Полученные результаты показали, что нормализации гомеостаза под действием пептидов сопутствовало уменьшение заболеваемости ОРЗ до 2,4 раз, снижением случаев обострения ИБС и гипертонии, остеопороза и деформирующего остеоартроза против контрольной группы. Такое существенное улучшение самочувствия участников, получавших пептиды, коррелировало со снижением смертности по сравнению с контролем во время эксперимента: в ~1,7 раза у получавших эпиталамин, в ~2 раза у принимавших тималин; в 2,5 – у получавших комбинацию тималин плюс эпиталамин. Участники, которым назначили эпиталамином с тималином на шестилетний период, показали четырехкратное снижение смертности против контроля. Эти результаты подтвердили выраженное геропротекторное действие эпиталамина и целесообразность его применения в медицине для поддержания здоровья пожилых пациентов и продления их активного долголетия [15].

В работе [16] исследовано действие мелатонина и эпиталамина на интенсивность свободнорадикального окисления и антиоксидантную активность в плазме крови крыс, как и их эффект на процессы, вызываемые свободными радикалами в печени, мозге и сыворотке на мышах. Эпиталамин животным инъецировали подкожно утром на протяжении пяти дней по 0,5 мг. Мелатонин назначили другим животным в течение того же периода времени (водный раствор для питья, 20 мг/л). Эпиталон подкожно вводили мышам пять дней подряд по 0,1 мкг пептида в 0,1 мл раствора. Было показано, что эпиталамин значительно снижал, в 3,4 раза, хемолюминесценцию сыворотки крови и перекисное окисление липидов – четырехкратно. Лечение эпиталамином или мелатонином было связано со значительным увеличением (на 35%) общей антиоксидантной активности. Через семь дней лечения эпиталамином активность супероксиддисмутазы (СОД) увеличилась на ~20%; мелатонин подавил активность на ~37%. Церулоплазмин сыворотки крови умеренно демонстрировал те же тенденции. У крыс, получавших эпиталамин, уровни церулоплазмина и СОД оказались на 75% больше, чем у крыс, получавших мелатонин [16]. Было показано, что пептидные препараты из шишковидной железы (эпиталамин и эпиталон) обладают антиоксидантными свойствами, превосходящими эффекты мелатонина, который также вырабатывается шишковидной железой.

Пептиды KE, KED, AED, AEDG, разработанные группой Хавинсона, были изучены в работе [17] на крысиных фибробластах кожи. Их растворы вводили в культуру после каждого пересева. Культуры клеток после 3 пассажей были отнесены к молодым, а после 14 – к старым. Все культивируемые объекты были разделены в 5 групп и выращивались в присутствии солевого раствора (1, контроль), AED (2), KED (3), KE (4) и AEDG (5). Изучаемые соединения вводили в культуру до их содержания 20 нг/мл. Влияние пептидов на пролиферацию (Ki-67), старение и регенерацию (CD98hc), апоптоз (каспазу-3) и ремоделирование внеклеточного матрикса (MMP-9) определяли микроскопически по иммунофлуоресценции. Пептиды KE, AED, AEDG и KED повышали выработку маркера функциональной активности клеток CD98hc в молодых культурах в 1,2–2,9 раза, тогда как в старых – до 6,8 раз. Каждый из исследованных препаратов ингибировал экспрессию ММР-9, признак старения фибробластов, и повышали для Ki-67 и CD98hc, которые менее интенсивно синтезируются по увеличению времени жизни культуры. AEDG и AED подавляют каспаззависимый апоптоз, усиливающийся при старении клеточных культур [17].

Целью исследования [18] была оценка результатов длительного применения пептидов эпифиза (ПЭ) у пожилых пациентов с ИБС. 9 пациентов со стабильной стенокардией в возрасте 65±3 лет с низким ночным уровнем мелатонина шишковидной железы (<40 нг/л в 3 часа ночи) были распределены в две группы. Группе 1 (n = 39) вводили ПЭ на протяжении трех лет (10 мг один раз в три дня, 5 введений за каждый курс, промежутки между курсами – по полгода). Группе 2 (n = 40) не назначали ПЭ. Пациенты каждой группы получали низкие дозы ацетилсалициловой кислоты, ингибитора ACE, бета-блокатора и статина. Результаты оценивали путем измерения ночного уровня мелатонина, показателей физической работоспособности, липидов крови и глюкозы, а также проверили причины гибели людей за 15 лет. После 1-го и последующих курсов применения ПЭ произошло более чем двукратное увеличение ночного мелатонина. На этом фоне была улучшена физическая выносливость и снизились повышенные уровни холестерина. Уровень глюкозы в плазме также снижался – количество пациентов с непереносимостью глюкозы сократилось с 56% до 24%. Позитивных изменений в группе 2 замечено не было. Через 15 лет после от начала использования ПЭ в группе 1 осталось 26 из 39 выживших (66,7%). В группе 2 – только 16 из 40 (40%) пациентов с ИБС выжили за тот же период. Длительное использование ПЭ уменьшило смертность от сердечно-сосудистых заболеваний [18]. Таким образом, пептиды шишковидной железы восстановили активность шишковидной железы у пожилых пациентов с ИБС, улучшили их физическую работоспособность, липидный и углеводный обмен и значительно снизили риск преждевременной смерти из-за сердечно-сосудистых событий.

В новом обзоре 2020 года [19] авторы отмечают, что короткие пептиды с небольшой молекулярной массой способны проникать через клеточную мембрану и ядерную мембрану для дозозависимой эпигенетической регуляции экспрессии генов, включая гены, ответственные за дифференцировку клеток. Пептиды AEDG и AEDP индуцируют дифференцировку плюрипотентных клеток в эпидермисе, мезенхиме и нервной ткани. Пептиды KE, AED, KED, AEDG и AAAAEKAAAAEKAAAAEK активируют нейронную дифференцировку. Пептиды AEDL и KEDW вызывают дифференцировку клеток легких и поджелудочной железы. Дифференцировка лимфоцитов стимулируется пептидами KE, (Nα-(γ-E)-E), KED, K(Н-E-OH)-OH, DS, AED, EDA и KEDG. IRW, GRGDS и YCWSQYLCY активируют остеогенную дифференцировку. AEDL, KE, AEDG также вызывают дифференцировку растущих клеток. Такие пептиды способны оказывать эффект на активацию сигнальных путей, регулирующих экспрессию генов дифференцировки. Они могут взаимодействовать с гистонами, изменяя доступность генов для транскрипции, регулировать метилирование генов и активировать или ингибировать их экспрессию, и напрямую взаимодействовать с ДНК.

Заключение

Как видно из приведенных выше данных, препараты шишковидной железы нормализуют различные процессы в организме человека. Результаты экспериментов подтверждают, что короткие пептиды эпифиза усиливают антиоксидантную защитную систему, что может способствовать их геропротекторным свойствам. Клиническое изучение эпиталамина продемонстрировало улучшение ключевых показателей у пациентов пожилого и старческого возраста и снизило смертность за 15-летний период наблюдений. Это указывает на то, что пептиды эпифиза могут найти применение в клинической практике. Исследования в области направленной дифференцировки стволовых клеток с помощью пептидной регуляции имеют особое значение для разработки инновационных подходов к молекулярной медицине и терапии на клеточном уровне. Также очевидно, что синтетические методы получения пептидов являются наиболее приоритетными и позволяющими не только получать высокочистые продукты, но и модифицировать их молекулярную структуру, значительно усиливая полезные свойства препарата.

1.         Lowrey, P.L., Takahashi, J.S., Genetics of the mammalian circadian system: Photic Entrainment, Circadian Pacemaker Mechanisms, and Posttranslational Regulation. Annual Review of Genetics, 2000. 34(1): p. 533-562. DOI: 10.1146/annurev.genet.34.1.533.

2.         Espino, J., Pariente, J.A., Rodriguez, A.B., Oxidative Stress and Immunosenescence: Therapeutic Effects of Melatonin. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2012. 2012: p. 9. DOI: 10.1155/2012/670294.

3.         Anisimov, V.N., Khavinson, V.K., Morozov, V.G., Twenty Years of Study on Effects of Pineal Peptide Preparation: Epithalamin in Experimental Gerontology and Oncology. Annals of the New York Academy of Sciences, 1994. 719(1): p. 483-493. DOI: 10.1111/j.1749-6632.1994.tb56853.x.

4.         Pishak, V.P., Bulyk, R.E., Krivchanskaya, M.I., Pishak, O.V., Rol’ regulyatornyh peptidov shishkovidnoj zhelezy v hronoritmicheskoj organizacii gomeostaza [The role of a pineal gland regulatory peptides in the chronorhythmic organization of homeostasis]. Hronobiologiya i Hronomedicina [Chronobiology and Chronomedicine], ed. С.М. Чибисов, Рапопорт, С.И., Благонравов, М.Л. 2018, Moscow: Peoples’ Friendship University of Russia p. 828

5.         Приказ «О разрешении к медицинскому применению» от 19 июня 1990 года N 250. Министерство Здравоохранения СССР

6.         Khavinson, V.K., Izmaylov, D.M., Obukhova, L.K., Malinin, V.V., Effect of epitalon on the lifespan increase in Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development, 2000. 120(1): p. 141-149. DOI: https://doi.org/10.1016/S0047-6374(00)00217-7.

7.         Anisimov, V.N., Sredstva profilaktiki prezhdevremennogo stareniya (geroprotektory) [Prevention of premature aging (geroprotectors)]. Uspekhi Gerontologii [Advances in Gerontology], 2000. 4: p. 275-277.

8.         Sewald, N., Jakubke, H.-D., Peptides: Chemistry and Biology. 2002, Darmstadt: Wiley-VCH. p. 590.

9.         RU 2126258 C1, 1999.

10.       RU 2136296 C1, 1999.

11.       RU 2161501 C1, 2001.

12.       Yelamanchi, S.D., Kumar, M., Madugundu, A.K., Gopalakrishnan, L., Dey, G., Chavan, S., Sathe, G., Mathur, P.P., Gowda, H., Mahadevan, A., Shankar, S.K., Prasad, T.S.K., Characterization of human pineal gland proteome. Molecular BioSystems, 2016. 12(12): p. 3622-3632. DOI: 10.1039/C6MB00507A.

13.       Khavinson, V.K., Kopylov, A.T., Vaskovsky, B.V., Ryzhak, G.A., Lin’kova, N.S., Identification of Peptide AEDG in the Polypeptide Complex of the Pineal Gland. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2017. 164(1): p. 41-43. DOI: 10.1007/s10517-017-3922-8.

14.       Khavinson, V.K., Peptides and ageing. Neuroendocrinology Letters, 2002. 23(Suppl 3): p. 11-144.

15.       Khavinson, V., Morozov, V.G., Peptides of pineal gland and thymus prolong human life. Neuro Endocrinol Lett, 2003. 24(3-4): p. 233-240.

16.       Kozina, L.S., Arutjunyan, A.V., Khavinson, V.K., Antioxidant properties of geroprotective peptides of the pineal gland. Archives of Gerontology and Geriatrics, 2007. 44: p. 213-216. DOI: 10.1016/j.archger.2007.01.029.

17.       Lin’kova, N.S., Drobintseva, A.O., Orlova, O.A., Kuznetsova, E.P., Polyakova, V.O., Kvetnoy, I.M., Khavinson, V.K., Peptide Regulation of Skin Fibroblast Functions during Their Aging In Vitro. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2016. 161(1): p. 175-178. DOI: 10.1007/s10517-016-3370-x.

18.       Korkushko, O., Shatylo, V., Khavinson, V., Fifteen-year experience in application of pineal gland peptides in elderly subjects. Innov Aging, 2017. 1(suppl_1): p. 780-780. DOI: 10.1093/geroni/igx004.2827.

19.       Khavinson, V., Linkova, N., Diatlova, A., Trofimova, S., Peptide Regulation of Cell Differentiation. Stem Cell Reviews and Reports, 2020. 16(1): p. 118-125. DOI: 10.1007/s12015-019-09938-8.